ekzosomy_nano2004012ratushnyak-f1.gif

Рис. 1 - Схема формирования экзосом: 0, 1, 2, 3 – компоненты эндосомального комплекса сортировки (ЭКС), nSMase – сфингомиелиназа, МВТ – мультивезикулярное тельце, ИЛП – интралюминальные пузырьки [Источник: DOI: 10.1134/S1992722320040123].

Джагаров Д. Э. 
«Химия и жизнь» №6, 2013

Какой же морской роман без письма в засмоленной бутылке, которую несет течение? До появления радио и телеграфа бутылочная почта нередко становилась последней надеждой для попавшего в беду корабля и его экипажа.

Примерно такой же почтой пользуются живые клетки. Время от времени они выделяют в межклеточное пространство крохотные пузырьки, которые, попадая в кровоток, разносятся по всему организму. Встретив клетку — адресата послания, они узнают ее с помощью молекул, расположенных на их поверхности, затем, попав внутрь клетки, сообщают ей, как живут-поживают клетки-отправители и что делать дальше ей самой.

Первоначально эти крошечные пузырьки-везикулы рассматривались как резервуары для удаления избытка клеточной цитоплазмы и считались побочным продуктом жизнедеятельности клеток. С момента их открытия и до начала XXI века никто ими особенно не интересовался. Потом выяснилось, что они обладают способностью регулировать иммунные реакции организма. Когда же в 2007 году в них были обнаружены нуклеиновые кислоты — носители генетической информации, стало ясно, что это вовсе не мусорные контейнеры.

Отправить и получить

Задумывались ли вы когда-нибудь над тем, как из оплодотворенной яйцеклетки развивается сложнейшее по архитектуре строение, именуемое организмом? Строение, состоящее из многих миллионов клеток, каждая из которых выполняет свою, именно ей предназначенную функцию, четко согласуя ее с общим планом действий. И это волшебство происходит прямо у нас на глазах, с нами самими (взгляните на себя в зеркало и сравните с вашей фотографией в раннем детстве).

Чтобы клетки могли координировать свои действия, существуют механизмы межклеточной коммуникации. Клетки общаются или путем прямого контакта, или выделяя сигнальные молекулы (в том числе гормоны, ростовые факторы, нейромедиаторы). Теперь мы знаем, что есть еще один способ — межклеточная передача мембранных пузырьков.

Пузырьки воздействуют на клетку-адресата гораздо более сложными способами, чем отдельные молекулы, так как содержат многочисленные белки, липиды и даже нуклеиновые кислоты. Дополнительное удобство в том, что содержимое пузырька окружено мембраной, которая предохраняет их от воздействия среды, как прочное стекло бутылки защищает письмо от влаги. Рецепторы на поверхности мембраны обеспечивают доставку точно по адресу (и в этом отличие от бутылочной почты: попасть «не в те руки» письмо не может). Путешествуют посылки наиболее экономичным «водным транспортом» — с жидкостью, циркулирующей по кровеносным артериям и лимфатическим сосудам. Таким образом обеспечивается обмен информацией между удаленными клетками, в разных органах и разных частях тела.

Бутылочная почта организма может доставлять не только чистую информацию, но и полезные предметы, способные открыть перед получателем новые горизонты. Например, внеклеточные пузырьки, называемые экзосомами, переправляют от нейронов к мышечным клеткам мембранный белок синаптотагмин 4. Он нужен для формирования нервно-мышечного соединения (синапса), через которое передаются электрические сигналы от нейронов к мышечным клеткам. Производится этот белок в нервных клетках, а используется в мышечных, так что без пересылки тут не обойтись.

Классификация

В зависимости от того, как образуются внеклеточные пузырьки и какой они величины, их называют апоптозными тельцами, эктосомами или экзосомами.

Апоптозные тельца, они же апотельца, — это ограниченные плазматической мембраной фрагменты клетки, образующиеся в результате апоптоза — регулируемой организмом самоликвидации клетки. Они имеют размер около 50–5000 нм в диаметре и могут содержать органеллы или даже фрагменты ядра погибшей клетки.

Эктосомы, или почкующиеся микровезикулы, образуются путем выпячивания плазматической мембраны из клетки наружу; выпуклость отшнуровывается от мембраны клетки и превращается в пузырек. Это довольно крупные пузырьки — обычно от 50 до 200 нм, иногда достигают и 1000 нм в диаметре.

Экзосомы — небольшие пузырьки (обычно от 40 до 100 нм). Первоначально они образуются внутри клетки — почкуются в полость, называемую эндосомой. Когда в этой полости накапливается достаточно много экзосом, дальнейшая ее судьба зависит от того, какими липидами промаркирована ее мембрана. Если эндосома помечена лизобисфосфатидиловой кислотой, то ее содержимое будет уничтожено — она сольется с лизосомой, мембранным пузырьком, наполненным ферментами, которые расщепляют белки, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты. Если же мембрана эндосомы содержит церамиды — это сигнал «отправить почту»: эндосома сливается с поверхностной мембраной клетки и множество экзосом выталкивается наружу, во внеклеточную среду (см. рисунок). Руководят этими процессами небольшие ГТФазы (ферменты, которые связывают и гидролизуют гуанозинтрифосфат) семейства Rab. Если «почтовая» функция апотелец и эктосом еще остается под вопросом, то для экзосом она доказана точно.

Образование экзосом и эктосом, передача их от клетки-отправителя к адресату. Внизу — «обобщенная» экзосома в увеличенном виде

Экзосомы и эктосомы были обнаружены в самых разных полостных жидкостях организма, а также в моче, сперме, сыворотке крови, лимфе, слюне, слезах, выделениях из носа, желчи, околоплодных водах и даже в грудном молоке. Производить экзосомы, как теперь известно, способна почти любая наша клетка — от клеток желудочно-кишечного тракта и желез внутренней секреции до клеток кожи и мозга.

Различить апотельца, эктосомы и экзосомы после того, как они оказались в жидкости, непросто, но возможно. Так, мембраны апотелец и эктосом богаты фосфатидилсерином, а экзосомы содержат характерные белки, например Alix — многофункциональный белок, задействованный среди прочего и в биосинтезе экзосом.

Характеристики экзосом, микровезикул и апоптозных телец

За последние годы собрана обширная информация о компонентах внеклеточных пузырьков из различных типов клеток и жидкостей. Оказалось, что состав их белков, липидов, микроРНК и матричных РНК сильно зависит от происхождения пузырьков, а также от физиологического состояния породившей их клетки, от того, здорова она или больна. Как правило, все экзосомы содержат аннексины, которые регулируют процессы слияния ее мембраны с мембраной клетки; ГТФазы Rab, молекулы адгезии и рецепторы, помогающие экзосоме причалить к клетке-мишени; а также белки ESCRT (эндосомного комплекса сортировки предназначенных для транспортировки белков и РНК — что-то вроде аналога портовой службы маркировки-сортировки). Главный маркер экзосом — трансмембранные белки CD63, CD81 и CD9 из семейства тетраспанинов. (CD-маркеры, или антигены, от англ. cluster of differentiation — это поверхностные белки, которые используются для идентификации клеток. Лимфоциты или стволовые клетки разных типов не всегда можно различить «на глаз», но мы можем узнать, к какому типу принадлежит клетка, если выясним, какие CD-антигены она несет.) Кроме того, экзосомы, как и клетки, несут на мембране белки главного комплекса гистосовместимости (МНС, от англ. major histocompatibility complex) и белки теплового шока, они же белки стресса (HSP60, HSP70, HSP90). Те и другие принимают участие в связывании антигенов и предъявляют эти антигены иммунной системе. Белки МНС отвечают также за распознавание «своих» и «чужих» клеток и тканей.

Иммунный ответ

Способность мембранных пузырьков транспортировать информацию впервые была показана в исследованиях экзосом из В-лимфоцитов. Оказалось, что они несут на себе белки главного комплекса гистосовместимости — МНС класса II, связанные с антигенным пептидом, иными словами, конструкцию, необходимую для иммунного ответа. И несут они ее не куда-нибудь, а в специализированные Т-клетки, то есть служат посредниками на этом важнейшем этапе. Аналогичным образом экзосомы переносят комплексы MHC класса I c пептидным антигеном из дендритных клеток в так называемые наивные Т-лимфоциты. (О дендритных клетках и об их роли в иммунной системе «Химия и жизнь» писала в ноябрьском номере 2011 года, см.: «Иммунология в ожидании прорыва».) Получив такое «письмо», Т-лимфоциты перестают быть наивными и готовы опознать антиген обидчика и сразиться с ним. Примерно так же экзосомы распространяют антигены и их комплексы с MHC между дендритными клетками, благодаря чему растет число клеток, представляющих тот или иной антиген.

«Экзосомной почтой» пользуются клетки-макрофаги, зараженные вирусами или бактериями, — они отправляют антигены инфекционного агента, и это тоже приводит к активации Т-клеток. Аналогичный эффект дают экзосомы, выделяемые опухолевыми клетками при воспалении, которые несут антигены опухоли.

Если дендритная клетка незрелая или выделяет цитокины, тормозящие иммунный ответ, ее экзосомы несут подавляющие иммунитет молекулы. Это способствует развитию иммунной толерантности, противодействует воспалительным процессам, а значит, может быть полезным для лечения аутоиммунных заболеваний.

Другой случай полезного подавления иммунной реакции — экзосомы, выделяемые клетками плаценты в кровь матери. Они несут на себе фактор FasL, ингибирующий Т-клетки и NK-клетки (от англ. natural killers — «естественные убийцы»), и предотвращают иммунную атаку крови матери против плода. Подобные экзосомы найдены также в молозиве и молоке кормящей матери.

Кстати, сами NK-клетки тоже выделяют экзосомы, образно названные «нанопулями против опухолей». Они содержат две «молекулы-убийцы»: перфорин, который проделывает дырки в плазматической мембране клетки-мишени, и тот же самый лиганд FasL, который взаимодействует с трансмембранным белком FasR — рецептором, запускающим апоптоз.

К сожалению, инфекции и опухоли распространяются по организму и спасаются от иммунного надзора также с помощью экзосом. Появляется все больше доказательств, что экзосомы из опухолей ингибируют иммунный ответ и содействуют ангиогенезу (образованию новых кровеносных сосудов), тем самым способствуя росту новообразования. Кроме того, опухолевые экзосомы могут провоцировать образование метастазов, активируя миграцию опухолевых клеток и подготавливая им на новом месте так называемую метастазную нишу — микроокружение, способствующее укоренению и росту.

Перенос генетического материала

В 2007 году было обнаружено, что экзосомы, продуцируемые тучными клетками, содержат не только белки, но РНК. Это были как матричные РНК, содержащие информацию об аминокислотной последовательности белков, так и функционально активные малые РНК — некодирующие молекулы длиной около 22 нуклеотидов, которые принимают участие в регуляции экспрессии генов. РНК, курсирующие с помощью экзосом от одной клетки к другой, были названы челночными, или шаттл-РНК (exosomal shuttle RNA — esRNA).

Очевидно, молекулы РНК упаковываются в экзосомы не случайным образом. Так, в экзосомы почти не попадает РНК, входящая в состав рибосом. Кроме того, набор микроРНК и мРНК в экзосоме не вполне отражает содержание этих РНК в родительских клетках. Например, в клетках аденокарциномы крысы обнаружено более 8000 различных мРНК, а в экзосомах из этих клеток их не более 1500.

По сравнению с клеточными РНК экзосом более стабильны и устойчивы к деградации при длительном хранении и повторных циклах замораживания и оттаивания. Полезное качество для потенциальных диагностических и лечебных препаратов!

Передача микроРНК — один из ключевых путей взаимодействия между стволовыми клетками и их микроокружением, так называемой нишей. Этим путем пользуются и раковые клетки. Передача микроРНК экзосомой из раковой клетки влияет на экспрессию генов в клетке-мишени, способствуя распространению метастазов.

Естественно, возникает вопрос: можно ли при необходимости заблокировать пересылку микроРНК? Подсказкой может оказаться тот факт, что их перенос регулируют церамиды — липиды, которые входят в состав мембран и играют роль сигнальных молекул; мы их уже упоминали в начале, когда рассказывали о секреции экзосом. В опытах in vitro удавалось создать дефицит церамидов, подавив активность фермента сфингомиелиназы. (Этот фермент расщепляет сфинголипиды — основной компонент мембраны, причем высвобождаются церамиды.) Действительно, после этого секреция экзосом приостановилась.

Помимо РНК экзосомы содержат еще и мобильную ДНК, например митохондриальную. Во внеклеточной жидкости, в том числе в плазме крови, присутствуют ферменты, разрушающие ДНК и РНК, вот почему молекулы — носители генетической информации должны путешествовать от одной клетки к другой внутри мембранных микропузырьков. Подробнее о нуклеиновых кислотах экзосом можно прочитать в недавнем обзоре О. Н. Гусаченко, М. А. Зенковой и В. В. Власова из Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН («Биохимия», 2013, 78(1), 5–13).

Регенерация

Экзосомы, по всей видимости, играют важную роль в восстановлении поврежденных органов. Всё больше данных свидетельствует о том, что внеклеточные везикулы, секретируемые из гемопоэтических стволовых клеток-предшественников, мультипотентных клеток стромы или сердечных стволовых клеток, обладают уникальными свойствами. Они защищают клетки, оставшиеся в поврежденных тканях, от апоптоза, стимулируют деление выживших клеток и рост сосудов.

За счет чего это происходит? Во-первых, мембраны этих везикул обогащены биологически активными липидами, такими, как близкий родственник церамидов сфингозин-1-фосфат. Во- вторых, на их поверхности синтезируются антиапоптозные и стимуляторные ростовые факторы и цитокины. В-третьих, они целенаправленно доставляют в поврежденные ткани мРНК, регуляторные микроРНК и ферменты, и вся эта «гуманитарная помощь» повышает способности клеток к регенерации.

Например, мезенхимальные стволовые клетки посылают с помощью экзосом в поврежденные клетки канальцев почек матричную РНК рецептора инсулиноподобного ростового фактора-1. В клетках начинается синтез этого рецептора, и регенерация идет активнее. Подобные механизмы перепрограммирования поврежденных клеток стволовыми могут быть задействованы и при инфаркте миокарда. В экспериментах на животных даже однократное введение экзосом мезенхимальных стволовых клеток уменьшает размер инфаркта и улучшает состояние подопытных. Очевидно, экзосомы восполняют дефицит ферментов, важных для снабжения клетки энергией, а значит, и для скорейшей реабилитации сердечной мышцы.

Старение

Недавно было обнаружено, что длительность жизни нейронов мозга зависит от среды, в которой они находятся. Если пересадить нейроны мыши в мозг крыс, живущих намного дольше мышей, продолжительность жизни этих нервных клеток может более чем вдвое превысить средний срок, отмеренный природой мышам. Исследования методом гетерохронного парабиоза, при котором кровеносные системы двух животных разного возраста объединяют хирургическим путем, показали, что при этой операции старое животное молодеет, а молодое, наоборот, стареет. Очевидно, возрастное снижение активности клеток может быть результатом воздействия циркулирующих в крови факторов, состав которых меняется с возрастом.

В недавно опубликованном обзоре Ден Сюй из Китая и Хидетоши Тахара из Японии («Advanced drug delivery reviews», 2013, 65, 3, 368–375, doi: 10.1016/j.addr.2012.07.010) обосновали гипотезу о том, что важнейшую роль в координации процессов клеточного старения выполняют экзосомы, а точнее, переносимые ими микроРНК. Некоторые из них могут способствовать старению, запуская сигнальные пути, ведущие к одряхлению организма, другие защищают от этих процессов. Экзосомы из состарившихся клеток с помощью своей микроРНК так изменяют микроокружение, что оно начинает благоприятствовать возрастным заболеваниям, понижению иммунитета, воспалению и нарушению функций различных органов. В обзоре приведен список кандидатных микроРНК, как способствующих, так и противодействующих старению.

Диагностика

Революционеры стремятся захватить почту и телеграф, реформаторы продвигают свои идеи через СМИ и социальные сети. Кто контролирует обмен информацией, тот владеет миром. Из предыдущих главок понятно, что исследования экзосом имеют огромную практическую значимость.

Например, они могут сказать многое о состоянии организма. Из экзосом, содержащихся в плазме крови, моче и других биожидкостях, можно получить микроРНК для диагностики. Как уже говорилось, липидная оболочка защищает РНК от агрессивных ферментов, поэтому возможность их деградации при транспортировке и хранении образцов невелика. Результаты такого анализа помогут не только поставить диагноз, но и определить стадию заболевания, выяснить, прогрессирует ли оно или вошло в стадию ремиссии, проверить эффективность лечения.

Экзосомы содержат белки, микроРНК и матричную РНК той клетки, из которой они произошли. Повышенный уровень микроРНК-155 характерен при наличии провоспалительных макрофагов и атеросклеротических поражений. МикроРНК семейства Let-7 в экзосомах может свидетельствовать об активном размножении клеток, а значит, о растущей опухоли. Появление в плазме крови типичной для сердечной мышцы микроРНК-208а и изменения уровня некоторых других микроРНК могут быть использованы для ранней диагностики повреждения миокарда. Характерный состав микроРНК имеют также экзосомы из нейронов, зараженных прионами — инфекционными белками, вызывающими тяжелые заболевания центральной нервной системы, такие, как куру или «коровье бешенство». И подобных примеров, демонстрирующих возможности диагностики по экзосомам, с каждым днем становится больше.

Еще один плюс диагностики по экзосомам — вместо весьма болезненной и порой небезопасной хирургической биопсии тканей можно исследовать жидкости и получить ту же информацию. Это особенно важно при диагностике рака головного мозга, например глиомы, когда проведение множества биопсий может быть опасным для жизни пациента. Исследование РНК экзосом, выделенных из крови и спинномозговой жидкости, позволит ученым проводить тест на наличие опухоли и наблюдать за ее изменениями, не проводя биопсию.

Специалисты компании “Exosome Diagnostics” (США) разработали набор для выявления рака предстательной железы, обладающий точностью 75%. Первые наборы для диагностики по образцам экзосом, полученных из мочи, можно будет приобрести уже в конце 2013 года.

Диагностика по экзосомам в ближайшее время, вероятно, станет доступна даже небольшим медицинским лабораториям, оснащенным обычной микроцентрифугой. Это сделает возможным очень простая, не требующая ультрацентрифугирования методика получения экзосом. Ее разработала американская компания “System Biosciences”. Группа американских исследователей разработала также высокочувствительный аналитический прибор для быстрого изучения микровезикул непосредственно в образцах крови пациентов (Nature Medicine, 2012, 18, 1835–1840, doi:10.1038/nm.2994). Кровь пропускают через микрожидкостной чип, в котором микровезикулы метят моноклональными антителами, связанными с магнитными наночастицами, а затем выявляют с помощью миниатюрной детекторной системы, использующей ядерный магнитный резонанс. Всего из 0,1–0,5 мл сыворотки крови или другой биологической жидкости можно получить достаточно РНК или белка экзосом, чтобы провести экспресс-диагностику.

Терапия

Возможно, экзосомы окажутся идеальным средством доставки лекарств. Они предохраняют свое содержимое от разрушения и могут переносить его через плазматическую мембрану. Кроме того, эти мембранные пузырьки, самой природой предназначенные для межклеточного обмена, хорошо переносятся организмом, о чем свидетельствует их присутствие в биологических жидкостях. Они избирательно находят клетки-мишени, тем самым повышая эффективность переноса лекарственных препаратов, белков и РНК и снижая возможность побочных эффектов. Например, если препарат экзосом, заключающих в себе противовоспалительное лекарство, просто закапать в нос, лекарство будет доставлено в конкретные клетки мозга, то есть сможет пересечь гематоэнцефалический барьер.

Для массового производства экзосом предполагается использовать культуры человеческих мезенхимальных стволовых клеток, которые обладают способностью к пролиферации и иммуносупрессивной активностью (последнее важно, поскольку предотвращает атаку иммунной системы пациента). Уже удалось создать постоянную «промышленную» линию таких клеток, которая с течением времени не теряет способности к делению, полностью сохраняя и способность секретировать экзосомы.

Перспективное терапевтическое средство представляют собой экзосомы из культур NK-клеток — как нетрудно догадаться, потенциальное оружие против опухолей.

Конечно, есть и нерешенные проблемы. Коль скоро экзосомы несут на себе белки главного комплекса гистосовместимости, аллогенные, то есть взятые от другого человека экзосомы могут вызывать у пациента иммунный ответ, несмотря на иммуносупрессивную активность. Ключ к решению — вероятно, тщательный подбор донорских клеток для производства экзосом, а также получение культур аутологичных (собственных) мезенхимальных стволовых клеток пациента из индуцированных стволовых клеток.

На этой оптимистической ноте закончим статью. Если экзосомы оправдают надежды ученых, повод вернуться к «бутылочной почте» клеток представится «Химии и жизни» еще не раз.

Источник:

http://elementy.ru/lib/432105