Приготовление гистологических препаратов

Этапы приготовления гистологического препарата

1. Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата.

При этом учитываются следующие моменты: забор материала должен проводиться как можно быстрее и как можно раньше после смерти или забоя животного, а при возможности от живого объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клеток, ткани или органа. Забор кусочков тканей должен производиться острым инструментом, чтобы не травмировать клетки; толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог быстро проникнуть в толщу кусочка. Обязательно производится маркировка кусочка (указывается наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора и так далее).

2. Фиксация материала (или же просто замораживание отобранного материала для последующего изготовления тонких срезов в криостате).

Она необходима для прекращения (остановки) обменных процессов и предотвращения распада тканевых и клеточных структур. Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие жидкости. Ими могут быть специальные растворы различного состава. Например, простые спирты и формалин, глутаровый альдегид (глутаральдегид) в соответствующих концентрациях, а также сложные растворы: Карнуа, фиксатор Цинкера и другие. Фиксатор вызывает денатурацию белка и тем самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их прижизненном состоянии. Фиксация может достигаться также быстрым замораживанием (охлаждением в струе СО₂, в жидком азоте и т.п.). Продолжительность фиксации подбирается опытным путем для каждой ткани или органа.

3. Проводка фиксированного материала. Состоит из последовательного обезвоживания и последующей поэтапной заливки обезвоженных кусочков ткани в уплотняющие среды (парафин, целлоидин, смолы)

4. Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной микроскопии — монтируются на специальные сеточки.

5. Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов удаляется уплотняющая среда (депарафинизация). Окраской достигается контрастность изучаемых структур. Красители подразделяются на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко используются основные красители (обычно гематоксилин) и кислые (эозин). Нередко используют сложные красители.

6. Просветление срезов (в ксилоле, толуоле).

7. Заключение в смолы (бальзам, полистерол), закрытие покровным стеклом.

После этих последовательно проведенных процедур препарат может изучаться под световым микроскопом.

Для целей электронной микроскопии в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же. Главное отличие заключается в том, что гистологический препарат для световой микроскопии может длительно храниться и многократно использоваться. Срезы для электронной микроскопии используются однократно. При этом вначале интересующие объекты препарата фотографируются, а изучение структур производится уже на электронограммах.

Из тканей жидкой консистенции (кровь, костный мозг и другие) изготавливаются препараты в виде мазка на предметном стекле, которые также фиксируются, окрашиваются, а затем изучаются.

Из ломких паренхиматозных органов (печень, почка и другие) изготавливаются препараты в виде отпечатка органа: после разлома или разрыва органа, к месту разлома органа прикладывается предметное стекло, на которое приклеиваются некоторые свободные клетки. Затем препарат фиксируется, окрашивается и изучается.

Наконец, из некоторых органов (брыжейка, мягкая мозговая оболочка) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливаются пленочные препараты путем растягивания или раздавливания между двумя стеклами, также с последующей фиксацией, окраской и заливкой в смолы.

Дополнительно: 1Перейти