grad-green grad-gray grad-blue grad-red grad-pink grad-purple grad-yellow
Нести помощь людям

Вход на сайт

Репликация ДНК

 

Лекция 12. Репликация. Принципы. Синтез ДНК in vitro
 
Репликация ДНК
 
Определение
Репликация — это процесс, осуществляемый комплексом ферментов и белков, выполняющих топологическую функцию, суть которого в образовании идентичных копий ДНК для передачи генетической информации в поколениях клеток и организмов, называют репликацией ДНК.
 
Принципы репликации
1. Комплементарность.
2. Антипараллельность.
3. Униполярность.
4. Потребность в затравке.
5. Прерывистость.
6.Полуконсервативность.
 
Первые три принципа можно сформулировать в одной фразе:
Синтез каждой дочерней цепи ДНК идет комплементарно и антипараллельно матричной цепи и всегда в направлении 5'→ 3'.
 
Доказательство полуконсервативного характера репликации
Для выяснения вопроса о характере расхождения цепей по дочерним молекулам Мэтт Мезельсон и Фрэнк Сталь в 1958 г. разработали метод равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCl. .
ДНК разделяется не по молекулярным весам, а по удельной плотности.
E. сoli выращивали на протяжении нескольких поколений на среде, содержащей тяжелый изотоп азота (N15), для того, чтобы вся ДНК была "тяжелой". Перед очередным раундом деления клетки синхронизировали. При этом в среде заменяли N15 на легкий изотоп N14 с тем, чтобы вновь синтезированные цепи были "легкими". После репликации ДНК выделяли и центрифугировали в градиенте плотности CsCl.
Полуконсервативность означает, что каждая дочерняя ДНК состоит из одной матричной цепи и одной вновь синтезированной.
Равное распределение "тяжелых" и "легких" цепей между всеми молекулами исключало возможность консервативного способа, согласно которому одна дочерняя клетка получает материнскую ДНК, а другая - вновь синтезированную, обе цепи которой являются новыми.
Клетки второго поколения содержали как полностью "легкие" молекулы, так и "гибридные", состоящие из одной "легкой" и одной "тяжелой" цепи, аналогичные молекулам первого поколения. Этот факт исключал возможность дисперсного механизма, согластно которому куски материнской ДНК случайным образом распределяются между дочерними молекулами.
 
Ферментативная система синтеза ДНК in vitro
В 1956 г. Артур Корнберг наработал 100 кг биомассы E. coli и выделил 0.5 г фермента ДНК-полимеразы.
Необходимые компоненты для синтеза ДНК in vitro:
1. ДНК-матрица - образец, по которому строится новая цепь ДНК.
2. Активированные нуклеотиды (dАТФ, dГТФ, dТТФ, dЦТФ) - то, из чего строятся дочерние цепи.
3. ДНК-полимераза - то, что строит новую цепь ДНК.
4. Ионы магния - то, без чего фермент не работает.
ДНК-матрицу необходимо активировать.
Нативная двуцепочечная ДНК, не имеющая повреждений, не может эффективно использоваться в этой системе. Активировать ее можно либо денатурацией щелочью или нагреванием (1), либо обработкой экзонуклеазой III из E. сoli (2), либо внесением ников (одноцепочечных разрывов) с помощью эндонуклеаз (3).
 
Понятие о матрице и затравке
Продукты, образуемые в ферментативной системе in vitro.
 
 
Во всех случаях матрицей для синтеза новых цепей служит одноцепочечная ДНК. Затравкой является 3'-гидроксильный конец двуцепочечной ДНК, причем он должен быть спарен с матрицей.
В том случае, если эндонуклеаза вносила ники с 3'-фосфатным концом, ДНК не являлась активированной.
Прямым доказательством того, что затравка - 3'-гидроксильный конец, является эксперимент с дидезоксинуклеозидтрифосфатом.
 Если такой активированный нуклеотид сделать меченым по α-фосфату, то он включается в растущую полимерную цепь и всегда обнаруживается на ее 3'-конце. Это говорит о том, что он сам включается, но дальнейший рост цепи невозможен, т.к. нет 3'-гидроксильного конца.
Это также доказывает и униполярность репликации в направлении 5' →3'.
Строение и свойства ДНК-полимеразы Корнберга (ДНК-полимеразы I)
ДНК - полимераза Корнберга (ДНК-полимераза I) - это одна полипептидная цепь с молекулярным весом 109 тыс.
В состав полимеразы входят ионы цинка. Она абсолютно зависима от ионов магния.
Обнаружено 4 разные каталитические активности ДНК - полимеразы I:
1. Полимеризационная в направлении 5`→3`.ДНКn+dХТФ →ДНКn+1 + Ф-Ф
2. Пирофосфоролиз: ДНКn+Ф-Ф*ДНКn-1 + dХТФ* Эта активность возможна при большом избытке пирофосфатов.
3.Пирофосфатный обмен: ДНКn + dХТФ + Ф-Ф*→ДНКn+ dХТФ* + Ф-Ф
Фермент работает только тогда, когда он находится на молекуле ДНК и имеет соответствующую конформацию.
4.Гидролитическая активность: ДНКn + Н2О→ДНКn-1 + dХMФ
Эта активность имеет большой биологический смысл. Гидролитическая активность проявляется в направлении 3'5' и 5'3'.
Активность 3' 5' проявляется на неспаренном 3'-гидроксильном конце. Фермент возвращается при ошибке включения и "откусывает" неправильный нуклеотид.
Это корректорская функция фермента.
Все ДНК-полимеразы обладают этой активностью.
Фермент способен гидролизовать спаренный 5'-конец, расчищая себе дорогу и продолжая полимеризацию.
 
Если на пути фермента встречается короткий (меньше 10 нуклеотидов) неспаренный 5'-конец, то полимераза сначала проявляет эндонуклеазную активность и откусывает весь свисающий конец, а затем проявляет экзонуклеазную 5'3' активность т.е. откусывает по одному нуклеотиду.
Если неспаренный 5'-конец длинный, то фермент использует его как матрицу.

 Примягком расщеплении ДНК-полимеразы трипсином можно получить два активных фрагмента: один обладает полимеразной и 3'→5' гидро-литической активностью (фрагмент Кленова), другой - 5'3' гидролитической активностью.

Источники: Дымшиц Г.М. Молекулярная биология: http://www.medliter.ru/?page=get&id=012131

Ваша оценка: 
2.625
Средняя: 2.6 (16 проголосовавших)