Вирусы в биотехнологии

Нанобиотехнология и вирусы

«Нано-» в переводе с латинского означает «карлик», нанометр - это единица длины, равная 10^-9 м, что соответствует атомарно-молекулярному уровню строения вещества.

Нанобиотехнология - это область современной технологии, применяющая методы и подходы нанотехнологии для создания устройств и методов с целью изучения биологических систем. В рамках нанобиотехнологии изучаются также возможности использования живых систем, в том числе искусственно модифицированных, для создания наноустройств и разработок.

Наночастица - это частичка вещества размером менее 100 нм (в некоторых случаях эта величина возрастает до 200-1000 нм). Наночастицы представляют собой гомо- и гетероструктуры, состоящие из заранее рассчитанного числа атомов или молекул, взаимно ориентированных определенным способом [Нанотехнологии / Ред.: Ю.Д. Третьякова. - М.: Физматлит, 2008. - 368 с.].

В нанохимии к наночастицам относят гомо- или гетероатомные объекты с размером 1-10 нм, хотя в некоторых случаях они могут иметь и больший размер, но при этом должны обязательно проявлять свойства, отличные от компактного вещества и молекулярных кластеров.

Нанобиочастица - это частица или структура, сформированная природой или методами молекулярной биотехнологии из определенного, заранее заданного числа молекул с определенной характеристикой её составляющих: нуклеотидов, аминокислот, липидов, сахаров или их комбинации [академик РАМН А.И. Арчаков].

Кластеры - это частицы вещества, состоящие из 30-500 атомов, наночастицы - из 500-1 000 000 атомов. Но малые кластеры содержат от 3 до 12 атомов, а средние - от 13 до 150 и имеют размеры 8-20 Å . Кластеры с размером частиц от 20 до 100 Å называются гигантскими. В них число внутренних и внешних атомов соизмеримо. Считается, что именно к частицам подобного размера приложима приставка нано и они же наиболее интересны для материаловедения. Это объясняется тем, что именно для них наблюдается наибольшее количество аномалий в физических свойствах, именно эти вещества изучаются наиболее интенсивно и именно для них имеется наибольший массив информации (возможно, именно поэтому они и представляются наиболее интересными, чем все прочие кластеры).

Для частиц вещества с малыми размерами стали широко использоваться единицы измерения длины: 1 нм (нанометр) = 10^-9 м; 1 Å (ангстрем) = 10^-10 м; массы: 1 фг (фемтограмм) = 10^-15 г); объёма: 1 зл (зептолитр) = 10^-21 л; электростатической ёмкости: 1 аФ (аттофарада) = 10^-18 Ф; электростатической энергии заряда: 0.05 эВ. Исходя из того, что 1 Да равен 1.66 х 10- г и зная линейные размеры объекта, можно оценить массу и объём кластеров и наночастиц, содержащих разное число атомов.

Структурная перестройка спиральных вирусов растений в сферические частицы-платформы

Перспективным направлением биотехнологии является разработка принципиально нового типа платформ — сферических частиц (СЧ), образуемых при кратковременном нагревании спиральных вирусов растений (с высвобождением РНК). Эти белковые частицы способны адсорбировать на своей поверхности самые разные антигенные детерминанты, образуя высокоиммуногенные вакцинные комплексы: СЧ-иммуногены. Так, при нагревании спирального вириона вируса табачной мозаики (ВТМ) до 94 °С происходит структурная перестройка вирусного белка и формируются СЧ контролируемого размера. Такие СЧ биодеградируемы, т.е. рарушаются организмом, они не содержат РНК, т.е. не приносят с собой в организм чужеродной наследственной информации, и в то же время обладают высокой стабильностью. Кроме того, СЧ, полученные из растительных вирусов, безопасны для человека, так как растения и животные не имеют общих патогенов. В то же время СЧ — эффективные иммуностимуляторы, запускающие иммунный ответ.

Вирус - против вируса: вакцина на основе СЧ ВТМ

Рассмотрим пример использования СЧ для создания вакцины против вируса птичьего гриппа.

Вакцина полученна посредством сборки in vitro комплексов, включающих иммуногенные эпитопы белков НА и М2 вируса птичьего гриппа А на поверхности сферических частиц на основе вириона вируса табачной мозаики.

Методика. Вирионы ВТМ (штамм U1) выделяли из инфицированных растений Nicotiana tabacum L. сорта Samsun. СЧ получали из очищенного препарата ВТМ (5 мг/мл) при 94 °С согласно протоколу: Atabekov J., Nikitin N., Arkhipenko M., Chirkov S., Karpova O. Thermal transition of native tobacco mosaic virus and RNA-free viral proteins into spherical nanoparticles. J. Gen. Virol., 2011, 92(2): 453-456 (doi: 10.1099/vir.0.024356-0). Размер полученных СЧ составил 612±41 нм.

Рекомбинантный белок, содержащий фрагмент молекулы НА вируса гриппа А (16 кДа), был сконструирован на основе штамма A/Kurgan/5/05. Синтез соответствующего фрагмента кДНК гена гемагглютинина осуществляли с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с праймерами H562-284-P (5'-GCGGATCCGGAGTGAAGCCTCTAATTTTA-AGAGATT-3') и H562-284-M (5'-CGTCTAGATTATTCACTTTTCATAATTA-TTGTTGAGTCCCCT-3'). Амплифицированный фрагмент клонировали по сайтам рестрикции BamHI и XbaI в вектор pQE30 («Qiagen N.V.», Германия). Рекомбинантный белок HA62/284 был экспрессирован в клетках Escherichia coli штамма M15 и очищен по стандартной методике. Рекомбинантный белок массой 26 кДа, содержащий эпитоп М2е (23 а.о.) белка М2 вируса гриппа А, слитый с белком дегидрофолатредуктазой, экспрессировали и очищали. Комплексы СЧ—НА62/284-М2е получали in vitro при инкубации белков HA62/284, M2e и СЧ в массовом соотношении 5:5:100 при 25 °С в течение 20 мин.

Выбор антигена. В качестве антигенов вируса птичьего гриппа А выбрали участок молекулы гемагглютинина (62-284-й а.о.) штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), содержащий основные вируснейтрализующие эпитопы, и консервативный N-терминальный внеклеточный домен матриксного белка М2 (пептид M2e длиной 23 а.о). Гемагглютинин — один из двух основных поверхностных белков вируса гриппа. Этот белок отвечает за связывание вириона с клеточными рецепторами и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. НА представляет собой главный поверхностный антиген вируса гриппа и служит основной мишенью для нейтрализующих антител. Исследования показали, что район молекулы с 62-го по 284-й а.о. содержит большинство нейтрализующих эпитопов, а также структурные элементы, необходимые для эффективного фолдинга рекомбинантного белка.

Мембранный белок М2 формирует ионные каналы в липопротеидной оболочке вириона. Фрагмент этого белка длиной 22 а.о. (внеклеточный домен М2 — M2e) экспонируется на внешней поверхности вирусной частицы. Пептид M2e эволюционно консервативен и практически идентичен для всех вирусов гриппа, циркулировавших в популяциях животных, включая пандемические вирусы. В связи с этим он может рассматриваться как перспективный эпитоп для разработки универсальной вакцины против гриппа.

Препараты изучали с помощью электронного микроскопа JEM-1011 («JEOL», Япония), оснащенного цифровой фотокамерой ES500W Erlangshen («Gatan», Япония). Микрофотографии анализировали в программе ImageJ (National Institutes of Health, США).

Специфичность. Антигенную специфичность комплекса СЧ—НА62/284-М2е исследовали методом иммунофлуоресцентной микроскопии. В качестве первичных антител использовали антисыворотку кролика, полученную к белку HA62/284, и мышиную антисыворотку к белку М2е вируса гриппа в разведении 1:100. В контрольных образцах стадия добавления первичных антител отсутствовала. Связывание первичных антител с комплексами детектировали при помощи вторичных ослиных антикроличьих антител, конъюгированных с флуорофором Alexa Fluor® 546 («Invitrogen», США), или вторичных куриных антимышиных антител, конъюгированных с флуорофором Alexa Fluor® 488 («Invitrogen», США). Анализ проводили с применением флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M («Carl Zeiss», Германия) с интегрированной камерой ORCAII-ERG2 («Hamamatsu», Япония).

В полученных in vitro комплексах СЧ—HA62/284-М2е, содержащих СЧ и рекомбинантные антигены HA62/284 и М2е вируса гриппа, белки на поверхности СЧ сохранили способность связываться со специфическими антителами к рекомбинантным белкам, что было подтверждено с помощью непрямой иммуннофлуоресцентной микроскопии с двумя различными флуорофорами. Флуоресценция на поверхности СЧ свидетельствовала о том, что оба антигена (HA62/284 и М2е) адсорбировались на одних и тех же сферических частицах и сохраняли антигенную активность в составе комплекса СЧ—HA62/284-М2е.

Важно, что все СЧ были связаны с молекулами целевого белка, при этом агрегаты антигенных комплексов, не ассоциированные с СЧ, отсутствовали. Следовательно, в анализируемом препарате не были обнаружены СЧ, свободные от антигена. В отрицательном контроле, когда рекомбинантные белки или первичные антитела к ним не использовались, флуоресценцию не наблюдали, что свидетельствовало об отсутствии неспецифического взаимодействия антивидовых антител, конъюгированных с флуорофором, с поверхностью СЧ. Таким образом, было показано, что адсорбция белков НА и М2е на поверхности СЧ не препятствует их связыванию со специфическими антителами к рекомбинантным белкам вируса гриппа А.

Иммуногенность. Иммуногенность комплексов СЧ—HA62/284-М2е изучали на самках лабораторных беспородных белых мышей в возрасте 6-8 нед массой 15-18 г, разделенных на 4 группы по 5 животных в каждой. Мышей внутрибрюшинно иммунизировали PBS (натрий-фосфатный буфер, phosphate-buffered saline; отрицательный контроль, I группа), свободными рекомбинантными белками HA62/284 и М2е (II группа), белками в смеси с адъювантом Фрейнда (III группа), комплексами СЧ—HA62/284-М2е (IV группа). Доза на одну инъекцию составляла 5 мкг HA62/284, 5 мкг М2е, 100 мкг СЧ; объем смеси, инъецируемой животному, — 0,2 мл. Всего провели 3 иммунизации с 2-недельным интервалом. Кровь для анализа брали через 1 нед после последней иммунизации.

Титр пула антисывороток определяли методом непрямого иммуноферментного анализа с помощью Multiscan FC («Thermo Scientific», США). В качестве антигенов использовали белки HA62/284 и М2е в концентрации 10 мкг/мл. Титром антисыворотки считали разведение, в котором оптическая плотность продукта ферментативной реакции вдвое превышала соответствующее значение в отрицательном контроле (неиммунная мышиная сыворотка).

Оценивая способность комплексов СЧ с белками НА и М2е гриппа А птиц стимулировать специфический иммунный ответ, лабораторных мышей иммунизировали, в одном случае, свободными белками НА62/284 и М2е или, в другом случае, комплексом СЧ—НА62/284-М2е.

Были получены кривые титрования антисывороток при иммунизации лабораторных мышей смесью свободных антигенов (♦), их смесью с добавлением адъюванта Фрейнда (■) и комплексом с СЧ (▲); контроль — неиммунная сыворотка ("иммунизация" раствором PBS (натрий-фосфатный буфер, phosphate-buffered saline) (•).

В сыворотках крови мышей, иммунизированных комплексом СЧ—НА62/284-М2е, наблюдалось значительное увеличение титра антител к вирусным антигенам по сравнению с таковым при введении свободных антигенов (в отсутствие СЧ). Так, при использовании СЧ, на поверхности которых одновременно адсорбированы белки М2е и НА62/284, титр антител к белку М2е составил 2,0*105, к белку НА62/284 — 2,4*105. В отсутствие СЧ в группах мышей, иммунизированных смесью НА62/284 и М2е, титр антисывороток был менее 4,0*104. Титры антисывороток, полученные при иммунизации мышей смесью белков НА62/284 и М2е с использованием адъюванта Фрейнда (одного из самых сильных стимуляторов иммунного ответа, применяемого только в лабораторной практике), составляли 3,0*105 и 3,6*105. Таким образом, адсорбция НА62/284 и М2е на поверхности СЧ значительно усиливала иммуногенность рекомбинантных белков при внутрибрюшинных инъекциях: она приводила почти к 10-кратному увеличению концентрации антител к белкам НА62/284 и М2е в сыворотке крови иммунизированных животных по сравнению с показателем при иммунизации свободными белками, что по эффективности сопоставимо с использованием адъюванта Фрейнда.

Свойства маркера. Важно отметить, что получение ветеринарных вакцин на основе структурно модифицированных вирусов растений (СЧ) позволяет создавать маркерные ветеринарные вакцины: сферические частицы, на которые вырабатывается определенная часть антител при вакцинации комплексом СЧ—патоген, могут выполнять роль маркера, что позволит отличить вакцинированных птиц от носителей полевого вируса.

Выводы. Итак, комплексы СЧ—НА62/284-М2е могут быть основой для создания рекомбинантной вакцины против вируса гриппа птиц. Преимущество подобного подхода при создании вакцинных препаратов заключается в их высокой эффективности, стабильности и адъювантной активности сферических частиц, а также безопасности и низкой себестоимости за счёт использования вирусов растений. Включение в состав вакцинного препарата консервативного пептида М2е должно обеспечить защиту как от сезонных, так и от вероятных новых пандемических вирусов. Кроме того, это маркерная вакцина, позволяющая различать вакцинированных и невакцинированных особей, что важно для оздоровления промышленных популяций птицы.

Источник: Кондакова О.А., Трифонова Е.А., Архипенко М.В., Никитин Н.А., Карпова О.В., Атабеков И.Г. Разработка вакцины против птичьего гриппа на основе структурно модифицированных вирусов растений // С.-х. биол., Сельхозбиология, S-h biol, Sel-hoz biol, Sel'skokhozyaistvennaya biologiya, Agricultural Biology. 2017. №4. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/razrabotka-vaktsiny-protiv-ptichiego-g... (дата обращения: 10.11.2020).

Вообще, вирусы растений, состоящие из идентичных субъединиц белка оболочки (БО) и РНК, могут применяться в качестве строительных блоков-матриц для создания различных бионеорганических мате-риалов: нанотрубок, нанопроводников, наноэлектродов, наноконтейнеров, для инкапсидации неорганических соединений и получения неорганических нанокристаллов (Atabekov J.G. Using viral structures as nanotechnology instruments // Nanotechnologies in Russia. 2008. Vol. 3. N 1–2. P. 128–137.).

Вирусный нанокомпозит - это химическая начинка в виде наночастицы, заключённая в биологически активную белковую оболочку вируса. Оболочка может быть природной, полученной путём мутации генома вируса или подвергнутой химической модификации. Такие нанокомпозиты способны адресно концентрироваться в участке организма, который является для них мишенью, повышая в нём локальную дозу химического вещества (например, лекарственного препарата), что обеспечит избирательность химического воздействия на тот или иной определённый тип клеток.

В нанохимии нанокомпозиты – это сложные объекты, состоящие из наночастиц и связующего, или двух и более типов наночастиц, или из них и связующего, но во всех случаях межчастичные взаимодействия в них становятся настолько сильными, что маскируют свойства изолированных частиц, т.е. весь объект приобретает новые свойства не типичные для составляющих его компонентов или фаз.

Обратная генетика позволяет получить целенаправленные изменения в геноме РНК-содержащих вирусов путём последовательного переписывания геномной РНК в кДНК, введения нужных мутаций в кДНК, переписывания кДНК в РНК и получение нового модифицированного РНК-вируса с заданными характеристиками.