Выделение плазмид

Общие принципы выделения нуклеиновых кислот (НК)

Пожалуй, самым распространенным «мокрым» методом в биологии является выделение нуклеиновых кислот. Именно от этого первого шага нередко зависит и результат многостадийного эксперимента — скажем, секвенирования важнейшего генома. Работать с нуклеиновыми кислотам приходятся сотрудникам лабораторий самых разных профилей, если они используют биотехнологические методы. И первым этапом работы всегда будет один из наиболее рутинных — выделение НК. Экстракция ДНК или РНК имеет решающее значение для всей последующей работы с ними (например, проведение ПЦР).

Требования к методам выделения НК

• Специфичны и подходят под особенности объекта, из тканей которого осуществляется экстракция.
• Экономичны по времени.
• Просты и не требуют высокоспециализированного оборудования.
• Включают в себя использование безопасных реактивов.
• Могут быть модифицированы под методы, с которыми предстоит дальнейшая работа.
• Максимально защищены от загрязнения (контаминации).

Этапы выделения НК

1. Лизис клеток — физический или химический. Так, если мы выделяем НК из листьев растения, то сперва необходимо их протереть (физически нарушить целостность клеток), а потом использовать специальный буфер. Возможно, также понадобится нагревание (для ускорения лизиса) или центрифугирование образцов (для разделения на фракции).
В качестве химического агента для лизиса используют специальные буферы. Они могут содержать буферные соли (например Tris-HCl) и ионные соли (например NaCl) для регулирования pH и осмолярности лизата. Иногда добавляют детергенты (такие как Triton X-100 или SDS), чтобы разрушить клеточную мембрану.
2. Очистка. После разрушения клеточной и ядерной мембран возникает необходимость удалить примеси — другие вещества, из которых состоят клетки. Добавление концентрированного солевого раствора приводит к выпадению осадка, в котором содержатся белки, липиды и сахара. Помним, что если они останутся вместе с ДНК, то изрядно навредят при ПЦР и/или секвенировании. НК остаются в растворе, лучшему отделению их от осадка способствует центрифугирование. Удалению белков также помогает добавление протеазы, которая их расщепляет и позволяет отделять от нуклеиновых кислот. Так можно избавиться, например, от белков-гистонов, на которые «намотана» ДНК в хромосомах.
3. Элюирование. Теперь НК необходимо удалить из раствора. Тут пригодится знание химических свойств интересующих нас кислот — они растворимы в воде, но не в спирте. Выходит, стоит нам добавить этанол или изопропиловый спирт, как появится осадок — это наша ДНК (или РНК). Осадок можно отделить от раствора при помощи центрифугирования. После удаляем спирт, и готово.

etapy-vydelenija-na.png

Рисунок. Основные этапы выделения нуклеиновых кислот. Сперва происходит лизис клеточных стенок, а затем и ядерных мембран. После осуществляется деградация белков, в том числе гистонов. Затем нуклеиновые кислоты отделяются от других клеточных компонентов. Источник изображения: рисунок Элины Стояновой https://biomolecula.ru/articles/vydeliaem-nukleinovye-kisloty-evoliutsii...

При выделении нуклеиновых кислот также важно отделить ДНК от РНК. Для этого полученный образец нуклеиновых кислот можно обработать рибонуклеазами, приводящими к деградации РНК, — тогда в растворе останется цельная ДНК; или же добавить дезоксирибонуклеазы — так получим РНК.

Выход ДНК можно оценить с помощью различных методов: определения оптической плотности, электрофореза в агарозном геле или с использованием флуоресцентных ДНК-связывающих красителей. Все три метода удобны, но имеют разные требования с точки зрения необходимого оборудования, различаются простотой использования и расчетов.

Оптическую плотность измеряют при 260 нм (A260). При такой длине волны ДНК наиболее сильно поглощает свет, и полученное число позволяет оценить концентрацию раствора. Сильное поглощение около 230 нм может указывать на то, что в очищенной ДНК присутствуют органические соединения или хаотропные соли. Отношение значений, полученных при 260 нм и 230 нм, показывает загрязненность ДНК солями. Концентрацию и выход можно определить после завершения гель-электрофореза путем сравнения интенсивности свечения полосы с ДНК образца с интенсивностью образца стандарта (маркера).

Основные реагенты для выделения НК

• трис-буфер — контролирует рН, взаимодействует с липополисахаридами и повышает проницаемость, а также лизирует клеточную мембрану;
• ЭДТА — работает как хелатирующий агент, блокируя потребность в кофакторе фермента ДНКазы, тем самым предотвращая деградацию ДНК;
• SDS — солюбилизирует белки ядерных и клеточных мембран;
• NaCl — нейтрализует отрицательный заряд ДНК, стабилизирует молекулу;
• MgCl2 — агент, который защищает и стабилизирует ДНК, блокируя отрицательный заряд липопротеидов;
• фенол — осаждает белковые примеси.

klassifikacija-metodov-vydelenija-na.png

Рисунок. Классификация методов выделения нуклеиновых кислот. Условно методы по выделению ДНК можно разделить на химические и физические. В первых задействованы химические свойства веществ, например, фенол-хлороформа или протеиназы K, в основе вторых — разделение согласно с физическими особенностями молекул. Источник изображения: Chauhan T. (2018). 10 different types of DNA extraction methods (updated). Genetic Education; https://biomolecula.ru/articles/vydeliaem-nukleinovye-kisloty-evoliutsii...

Характеристика разных методов выделения НК Перейти

Любой метод выделения НК включает в себя три основных пункта: 1) разрушение клеточных и ядерных мембран, 2) деградацию белков, 3) отделение НК от остального клеточного содержимого.

Появление и развитие ПЦР, секвенирования и других методов работы с нуклеиновыми кислотами привели к развитию методов их выделения. Совершенствование методов направлено на сокращение расходов и трудозатрат на выделение, использование нетоксичных реагентов и увеличение качества и количества выхода нуклеиновых кислот. Важнейшее направление в развитии методов - автоматизация процесса.

Источник: Стоянова Э. Выделяем нуклеиновые кислоты: эволюция методов (https://biomolecula.ru/articles/vydeliaem-nukleinovye-kisloty-evoliutsii...).

Что такое плазмиды Перейти   Видео: Плазмиды

Как выделяют плазмидную ДНК

Вооружившись знаниями общих принципов выделения НК, легко можно понять процессы выделения плазмидной ДНК из бактерий. Лучше один раз увидеть, чем сто раз услышать, поэтому рекомендую посмотреть видеоматериалы на эту тему.

Видео: Экстракция плазмидной ДНК

Видео: Получение плазмид