grad-green grad-gray grad-blue grad-red grad-pink grad-purple grad-yellow
Нести помощь людям

Вход на сайт

Биотехнологические векторы

Краткое описание: 
Библиографическая ссылка для цитирования: Сазонов В.Ф. Биотехнологические векторы [Электронный ресурс] // Кинезиолог, 2009-2021: [сайт]. Дата обновления: 12.10.2021. URL: https://kineziolog.su/content/biotekhnologicheskie-vektory (дата обращения: __.__.20__). _________________Биологические (биотехнологические) векторы – это биологические структуры, способные вносить чужеродный генетический материал в клетку: плазмиды, бактериофаги, вирусы.

Векторы для переноса генов

Термин "вектор" применяется в науке обычно в тех случаях, когда надо подчеркнуть существование определённого направления.

Так что уже по смыслу термина можно понять, что биологические векторы направляют искуственно внедрённую в них ДНК в интактные клетки-мишени. Для введения небольшого количества ДНК в бактериальные прокариотические безядерные клетки обычно используют плазмиды (мелкие кольцевые или линейные ДНК), и этот процесс совершается с помощью хлорида кальция (CaCl2). Такая плазмидная система биовекторов работает очень хорошо, но лишь для небольшого количества генетического материала, т.к. сами плзмиды - это небольшие молекулы. Плазмидные векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК, размеры которых не превышают 10 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). А вот для более крупных генов или групп генов уже требуются другие векторы.

Биологические (биотехнологические) векторы – это биологические структуры, способные вносить чужеродный генетический материал в клетку. К ним относятся: 1) плазмиды, 2) бактериофаги, 3) вирусы.

Эти биовекторы используются для внедрения в чужую клетку искусственно изменённой ДНК, которая называется рекомбинантной.

Рекомбинантная ДНК - это модифицированная молекула ДНК, полученная за счёт объединения in vitro (=«в стекле», «в пробирке», в искусственных условиях) разнородых фрагментов ДНК, которые в природе не существуют совместно.

Например, рекомбинантной ДНК называют плазмиду, в которую встроен участок ДНК, чужеродной для бактерии и не характерный в норме для подобной плазмиды.

Именно с помощью векторов в клетки-мишени можно внедрять генетически чужеродный для них наследственный материал и получать знаменитые ГМО - генетически модифицированные организмы.

Внедряемый ген имеет простое название: "вставка".

Ген-вставку можно выделить из существующего генома в виде кусочка (=фрагмента) ДНК, можно найти нужный ген в специальной "библиотеке генов", а можно синтезировать искусственный ген, которого не существовало в природе. Затем следует наштамповать множество его точных копий с помощью ПЦР (полимеразной цепрой реакции) и после этого начать вставлять эти гены в клетки-мишени.

Но тут возникает проблема. Если такой "голый" ген попадает в клетку, то на него в цитоплазме тут же набрасываются специальные ферменты нуклеазы, которые в норме как раз и существуют для расщепления ДНК. Они режут его на кусочки и в конечном итоге расщепляют до отдельных нуклеотидов, которые используются для построения собственной бактериальной ДНК. Вот для того-то и нужны векторы, чтобы решать эту проблему. Вектор защищает переносимый им ген от разрушения, доставляя его по назначению. Самый простой и популярный у генных инженеров вектор - это плазмиды.

Плазмиды

Плазмиды (=эписомы) - это отдельные кольцевые или линейные молекулы ДНК у бактерий, которые определяют внехромосомную наследственность бактериальной клетки и предсталяют собой генетический элемент, способный к репликации в хозяйской бактериальной клетке и к длительному автономному существованию как внутри, так и вне её. Обычно это двухцепочечная кольцевая ДНК длиной 1-200 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов).

Количество плазмид у бактерии может быть разное, и чем больше плазмид, тем они мельче.

Плазмиды передают генетическую информацию от "своей" бактерии всем другим бактериям, даже если эти бактерии относятся к другим семействам. Какие же свойства придают плазмиды своим хозяевам-бактериям? Они содержат информацию о ферментах, обеспечивающих приспособление к использованию конкретного субстрата (вещества) в качестве источника питания или о ферментах, обеспечивающих устойчивость бактерий к различным неблагоприятным факторам среды: антибиотикам, ксенобиоикам и прочим.

Обычно плазмиды захватываются бактериями из окружающей среды и используются ими уже в качестве своих собственных дополнительных источников генетической информации.

Получается удивительная вещь: совокупный генофонд бактерий содержится не только в самих бактериальных клетках данного штамма (=разновидности), но и вне этих бактерий в свободном виде в окружающей среде, а также частично в бактериях других штаммов и даже семейств. Так что конкретная бактерия и даже популяция бактерий пользуются только лишь частью этого общего генофонда, но при необходимости в любое время могут позаимствовать из него подходящие для них гены. Это напоминает какое-то общедоступное внешнее хранилище информации, типа "облачного" сервиса в Интернете для хранения данных.

Т.к. захват плазмид из окружающей среды является для бактерий обычным делом, то плазмиды используются в биотехнологии в качестве векторов: в них встраивают нужные людям гены и таким образом эти гены вместе с плазмидой внедряются в бактерию и начинают в ней действовать.

Видео: Плазмиды  Экстракция плазмидной ДНК

Видео: Получение плазмид

Видео: Перенос гена в бактерию с помощью плазмиды

В качестве векторов в биотехнологии используются не только плазмиды, но также вирусы и бактериофаги.

Бактериофаги как биовекторы

Особенно удачный вектор был сконструирован на основе такого бактериофага, как колифаг λ.
Фаг λ — умеренный колифаг с длинным несократительным хвостовым отростком и днДНК-геномом (т.е. двунитевой дезоксирибонуклеиновой кислотой) размером 48502 п.н. (пар нуклеотидов). Центральная часть генома фага несущественна для его функционирования и используется для заместительной вставки клонируемой ДНК по единственному сайту узнавания для рестриктазы EcoRI. Сам по себе этот вектор слишком короток для упаковки в головку фага. И тут важно, что размеры головки накладывают ограничение не только на максимальную, но и на минимальную длину генома. А это означает, что укороченная рестриктазой ДНК фага уже не сможет занять его головку. Таким образом, чтобы получить фаг, способный размножаться с образованием зрелых фаговых частиц, в разрезанный родительский вектор обязательно должен быть встроен навязанный фагу фрагмент чужеродной ДНК. Это обстоятельство приводит к образованию автоматической селективной системы для отбора химерных фаговых геномов.

Рис. Фаг лямбда. Источник изображения: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/fd/Phage_lambda_v...

Для удобства отбора рекомбинантных фагов в несущественную область генома, используемую для вставки, вводят ген lacZ. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет.

Фаг M13 — нитевидный колифаг, имеющий кольцевой онДНК-геном. Для получения рекомбинантных ДНК используют репликативную форму фага, представляющую собой кольцевую двухнитевую ДНК размером 6400 п.н., в которую вставлен ген lacZ, содержащий полилинкер сайтов для целого ряда рестриктаз. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Использование векторов на основе фага M13 имеет ряд положительных моментов. Так, одно клонирование дает два вида фагов с однонитевым ДНК-геномом. Каждый вид фага содержит только одну из нитей вставки ДНК, которые могут находиться в разных ориентациях. В связи с этим, клонирование с использованием фага M13 удобно для создания однонитевых ДНК-зондов и секвенирования ДНК.
Попытка объединить преимущества плазмидных и фаговых векторов привела к созданию космид. Это плазмиды со встроенными специфическими последовательностями ДНК (cos — сайтами), отвечающими за Упаковку ДНК фага λ в фаговой частице. Такие векторы могут существовать в бактерии в виде плазмид, но могут быть выделены в чистом виде путем их упаковки в фаговые частицы in vitro. Ценность космидных векторов заключается в их большой емкости — то есть в возможности клонирования вставок большого размера. На длину этих векторов также накладываются ограничения, обусловленные размером головки фага, но в таком геноме не обязательно присутствие генов, необходимых для литического цикла.

Видеолекция: Бактериофаги

Лектор: Савченко Татьяна Алексеевна- кандидат медицинских наук, доцент, преподаватель кафедры " Микробиология и Вирусология" БГМУ

Содержание: распространение фагов 1:40-3:17 морфология фагов 3:18-6:09 взаимодействие фага с бактериальной клеткой 6:10-8:25 лизогения 8:26-10:21 методы культивирования фагов 10:22-11:56 применение фагов 11:57-16:29

Видеолекция: Бактериофаги и фаговая терапия Лектор: Куликов Евгений Евгеньевич, к.б.н., снс лаборатории вирусов микроорганизмов Института Микробиологии РАН им. С. Н. Виноградского, 2012.

 

 

Рисунок: Перенос генетического материала у бактерий с помощью плазмид

 

Рисунок: Конъюгация у бактерий. Источник изображения: https://slipups.ru/2320

Между двумя бактериями устанавливается односторонне направленный контакт — трубочка (pilus), по которой из клетки-донора в клетку-реципиент перемещаются плазмиды, в том числе и те, которые могут нести новые гены для реципиента. Перед переходом каждая плазмида разворачивается из кольца в цепочку и «переползает» в клетку реципиента, где снова собирается в кольцо. Благодаря конъюгации и плазмидам бактерия может передать новый эволюционный признак не только «дочкам», но и «соседям», т.е. не только «по вертикали», но и «по горизонтали».

Ваша оценка: 
3.142855
Средняя: 3.1 (7 проголосовавших)

Комментарии

А чо побольше нельзя было написать? Этого не хватит для ответа.