Биотехнологические векторы

Векторы для переноса генов

Термин "вектор" применяется в науке обычно в тех случаях, когда надо подчеркнуть существование определённого направления.

Так что уже по смыслу термина можно понять, что биологические векторы направляют искуственно внедрённую в них ДНК в интактные клетки-мишени. Для введения небольшого количества ДНК в бактериальные прокариотические безядерные клетки обычно используют плазмиды (мелкие кольцевые или линейные ДНК), и этот процесс совершается с помощью хлорида кальция (CaCl₂). Такая плазмидная система биовекторов работает очень хорошо, но лишь для небольшого количества генетического материала, т.к. сами плзмиды - это небольшие молекулы. Плазмидные векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК, размеры которых не превышают 10 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). А вот для более крупных генов или групп генов уже требуются другие векторы.

Биологические (биотехнологические) векторы – это биологические структуры, способные вносить чужеродный генетический материал в клетку. К ним относятся: 1) плазмиды, 2) бактериофаги, 3) вирусы.

Эти биовекторы используются для внедрения в чужую клетку искусственно изменённой ДНК, которая называется рекомбинантной.

Рекомбинантная ДНК - это модифицированная молекула ДНК, полученная за счёт объединения in vitro (=«в стекле», «в пробирке», в искусственных условиях) разнородых фрагментов ДНК, которые в природе не существуют совместно.

Например, рекомбинантной ДНК называют плазмиду, в которую встроен участок ДНК, чужеродной для бактерии и не характерный в норме для подобной плазмиды.

Именно с помощью векторов в клетки-мишени можно внедрять генетически чужеродный для них наследственный материал и получать знаменитые ГМО - генетически модифицированные организмы.

Внедряемый ген имеет простое название: "вставка".

Ген-вставку можно выделить из существующего генома в виде кусочка (=фрагмента) ДНК, можно найти нужный ген в специальной "библиотеке генов", а можно синтезировать искусственный ген, которого не существовало в природе. Затем следует наштамповать множество его точных копий с помощью ПЦР (полимеразной цепрой реакции) и после этого начать вставлять эти гены в клетки-мишени.

Но тут возникает проблема. Если такой "голый" ген попадает в клетку, то на него в цитоплазме тут же набрасываются специальные ферменты нуклеазы, которые в норме как раз и существуют для расщепления ДНК. Они режут его на кусочки и в конечном итоге расщепляют до отдельных нуклеотидов, которые используются для построения собственной бактериальной ДНК. Вот для того-то и нужны векторы, чтобы решать эту проблему. Вектор защищает переносимый им ген от разрушения, доставляя его по назначению. Самый простой и популярный у генных инженеров вектор - это плазмиды.

Плазмиды

Плазмиды (=эписомы) - это отдельные кольцевые или линейные молекулы ДНК у бактерий, которые определяют внехромосомную наследственность бактериальной клетки и предсталяют собой генетический элемент, способный к репликации в хозяйской бактериальной клетке и к длительному автономному существованию как внутри, так и вне её. Обычно это двухцепочечная кольцевая ДНК длиной 1-200 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов).

Количество плазмид у бактерии может быть разное, и чем больше плазмид, тем они мельче.

Плазмиды передают генетическую информацию от "своей" бактерии всем другим бактериям, даже если эти бактерии относятся к другим семействам. Какие же свойства придают плазмиды своим хозяевам-бактериям? Они содержат информацию о ферментах, обеспечивающих приспособление к использованию конкретного субстрата (вещества) в качестве источника питания или о ферментах, обеспечивающих устойчивость бактерий к различным неблагоприятным факторам среды: антибиотикам, ксенобиоикам и прочим.

Обычно плазмиды захватываются бактериями из окружающей среды и используются ими уже в качестве своих собственных дополнительных источников генетической информации.

Получается удивительная вещь: совокупный генофонд бактерий содержится не только в самих бактериальных клетках данного штамма (=разновидности), но и вне этих бактерий в свободном виде в окружающей среде, а также частично в бактериях других штаммов и даже семейств. Так что конкретная бактерия и даже популяция бактерий пользуются только лишь частью этого общего генофонда, но при необходимости в любое время могут позаимствовать из него подходящие для них гены. Это напоминает какое-то общедоступное внешнее хранилище информации, типа "облачного" сервиса в Интернете для хранения данных.

Т.к. захват плазмид из окружающей среды является для бактерий обычным делом, то плазмиды используются в биотехнологии в качестве векторов: в них встраивают нужные людям гены и таким образом эти гены вместе с плазмидой внедряются в бактерию и начинают в ней действовать.

vektorplazmida.png

Рисунок. Вектор из плазмиды.

Структура знаменитой плазмиды PBR322. В свое время это была, пожалуй, самая популярная плазмида во всем научном мире, а потом она стала основой для множества плазмид нового поколения. В ней есть участок начала репликации (ori), благодаря которому она может размножаться в клетках бактерии E. coli, гены устойчивости к двум антибиотикам — ампициллину (amp) и тетрациклину (tet), а также множество сайтов рестрикции (на самом деле их больше сорока, но здесь представлены только четыре — EcoRI, SalI, PstI, BamHI). Промоторные участки, к сожалению, не показаны, но они, разумеется, тут тоже есть. Некоторые сайты рестрикции находятся в генах устойчивости к ампициллину или тетрациклину, в результате чего и тот и другой сайт можно использовать в качестве второго селективного маркера. Например, если мы разрежем ген устойчивости к ампициллину с помощью рестриктазы PstI и вошьем в это место вставку, то тетрациклин будет первым селективным маркером, ампициллин — вторым, а селекция будет выглядеть так:

1. Трансформируем бактерии, выращиваем их на среде с тетрациклином и выбираем только хорошо растущие клоны.
2. Переносим эти клоны на среду с ампициллином и выбираем те, рост которых угнетается.

Если же мы вошьем вставку внутрь гена устойчивости к тетрациклину (разрезав его с помощью рестриктаз BamHI или SalI), то нам надо будет, наоборот, сначала посадить их на среду с ампициллином, а потом — с тетрациклином. Источник: «Википедия»

К настоящему времени синтезированы тысячи разнообразных плазмид, из которых созданы базы данных (например, AddGene). В этих базах есть плазмиды на все случаи жизни — с разными типами точек начала репликации, разными полилинкерами, разными селективными маркерами и промоторами и так далее. Есть те, в которые можно вшить не одну вставку, а несколько, а есть даже такие, которые уже несут в себе некоторые особенно популярные вставки. Поэтому, как правило, исследователи не синтезируют плазмиду для клонирования самостоятельно, а покупают уже готовую. При необходимости купленную плазмиду можно «довести до ума», вставив или убрав определенные участки (а потом эту модифицированную плазмиду тоже добавить в базу данных). Иными словами, часто задача ученого сводится просто к тому, чтобы подобрать подходящую плазмиду.

Допустим, исследователь подобрал подходящую плазмиду и получил нужную вставку. Теперь нужно соединить одно с другим, чтобы затем засунуть в клетки. Как это сделать? Воспользуемся тем, что в плазмиде существует несколько сайтов рестрикции — то есть, участков, в которых ее может разрезать нужная рестриктаза. Нам нужно выбрать такой подходящий сайт, который будет находиться в том месте, куда мы собираемся вшивать вставку, а затем обработать плазмиду соответствующей рестриктазой. После этого той же рестриктазой нужно обработать вставку, поскольку рестриктазы обычно оставляют выступающие концы на одной из нитей ДНК, и эти концы должны быть совместимы у вставки и плазмиды, чтобы они согласились соединиться. Если на кончиках вставки нет нужных сайтов рестрикции, то можно приделать к нему короткие ДНК-фрагменты с нужными сайтами рестрикции на концах.

И наконец, нам нужно соединить в одной пробирке плазмиду и вставку (предварительно очищенные от ферментов-рестриктаз) и добавить к ним ДНК-лигазу, которая умеет лигировать (то есть, сшивать воедино) две молекулы ДНК. Конечно, в результате мы получим не только желанный вектор, в котором плазмида соединена со вставкой, но и целый "коктейль" из побочных продуктов — пустую плазмиду (без нашей вставки), замкнутую вставку (без плазмиды), несколько сшитых между собой вставок (опять же без самой плазмиды) и так далее. В ходе селекции (отбора) эти ненужные продукты отсеются, и у нас в руках останется только желанный вектор.

Итак, далее мы проводим селекцию:

1. Увеличиваем компетентность бактерий, добавляем к ним «коктейль», полученный в результате лигирования, а потом высеваем эти бактерии на среду с антибиотиком, который является нашим первым селективным маркером;
2. Выбираем те бактериальные клоны, которые растут на среде с антибиотиком — они смогли съесть плазмиду со вставкой или хотя бы просто плазмиду (кота — с улыбкой или без);
3. Проводим с этими клонами второй этап селекции, в зависимости от того, какой ген мы использовали в качестве второго селективного маркера. Например, если этот ген — устойчивость к другому антибиотику, то мы переносим бактерии на среду с этим антибиотиком и выбираем те клоны, рост которых угнетается, — они ухитрились проглотить не просто плазмиду, а плазмиду, в которую была вшита вставка (кота с улыбкой);
4. Выращиваем полученную культуру бактерий.

И вот мы получили ее — бактериальную культуру, в которой живет созданный нами вектор.

Но если нам нужен чистый вектор, который можно будет потом засовывать в другие клетки, то у нас появляется проблема, которая на первый взгляд кажется неразрешимой. Как вызволить вектор из бактерий? Ведь даже если мы выделим из этих бактерий ДНК, то помимо вектора получим еще и совершенно ненужную нам бактериальную хромосому. Тут можно воспользоваться тем, что плазмидная ДНК имеет важные отличия от хромосомной: она, во-первых, гораздо меньше по размеру, а во-вторых, гораздо больше суперскручена. Поэтому можно подобрать такие условия, в которых бактериальные хромосомы будут осаждаться, в то время как плазмиды останутся плавать в растворе. Достаточно будет отцентрифугировать получившийся осадок (чтобы вся бактериальная ДНК прочно «упала на дно»), а затем уже из надосадочной жидкости выделить нашу плазмиду (обычно для этого используются специальные колонки, которые очень облегчают и ускоряют работу).

Плазмида — прекрасный вектор для относительно небольших вставок. Если ген-вставка слишком велик, то плазмида утрачивает стабильность, потому что ее участки начинают «перетасовываться» друг с другом и теряться при репликации, из-за чего она постепенно укорачивается. Поэтому в качестве вектора для длинных вставок используются более устойчивые конструкции.

Источник: https://biomolecula.ru/articles/molekuliarnoe-klonirovanie-ili-kak-zasun...

Видео: Плазмиды

Выделение плазмид Перейти

Видео: Перенос гена в бактерию с помощью плазмиды

В качестве векторов в биотехнологии используются не только плазмиды, но также вирусы и бактериофаги.

Бактериофаги как биовекторы

Особенно удачный вектор был сконструирован на основе такого бактериофага, как колифаг λ.
Фаг λ — умеренный колифаг с длинным несократительным хвостовым отростком и днДНК-геномом (т.е. двунитевой дезоксирибонуклеиновой кислотой) размером 48502 п.н. (пар нуклеотидов). Центральная часть генома фага несущественна для его функционирования и используется для заместительной вставки клонируемой ДНК по единственному сайту узнавания для рестриктазы EcoRI. Сам по себе этот вектор слишком короток для упаковки в головку фага. И тут важно, что размеры головки накладывают ограничение не только на максимальную, но и на минимальную длину генома. А это означает, что укороченная рестриктазой ДНК фага уже не сможет занять его головку. Таким образом, чтобы получить фаг, способный размножаться с образованием зрелых фаговых частиц, в разрезанный родительский вектор обязательно должен быть встроен навязанный фагу фрагмент чужеродной ДНК. Это обстоятельство приводит к образованию автоматической селективной системы для отбора химерных фаговых геномов.

phage_lambda_virion.svg_.png

Рис. Фаг лямбда. Источник изображения: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/fd/Phage_lambda_v...

Для удобства отбора рекомбинантных фагов в несущественную область генома, используемую для вставки, вводят ген lacZ. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет.

Фаг M13 — нитевидный колифаг, имеющий кольцевой онДНК-геном. Для получения рекомбинантных ДНК используют репликативную форму фага, представляющую собой кольцевую двухнитевую ДНК размером 6400 п.н., в которую вставлен ген lacZ, содержащий полилинкер сайтов для целого ряда рестриктаз. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Использование векторов на основе фага M13 имеет ряд положительных моментов. Так, одно клонирование дает два вида фагов с однонитевым ДНК-геномом. Каждый вид фага содержит только одну из нитей вставки ДНК, которые могут находиться в разных ориентациях. В связи с этим, клонирование с использованием фага M13 удобно для создания однонитевых ДНК-зондов и секвенирования ДНК.
Попытка объединить преимущества плазмидных и фаговых векторов привела к созданию космид. Это плазмиды со встроенными специфическими последовательностями ДНК (cos — сайтами), отвечающими за Упаковку ДНК фага λ в фаговой частице. Такие векторы могут существовать в бактерии в виде плазмид, но могут быть выделены в чистом виде путем их упаковки в фаговые частицы in vitro. Ценность космидных векторов заключается в их большой емкости — то есть в возможности клонирования вставок большого размера. На длину этих векторов также накладываются ограничения, обусловленные размером головки фага, но в таком геноме не обязательно присутствие генов, необходимых для литического цикла.

Видеолекция: Бактериофаги

Лектор: Савченко Татьяна Алексеевна- кандидат медицинских наук, доцент, преподаватель кафедры " Микробиология и Вирусология" БГМУ

Содержание: распространение фагов 1:40-3:17 морфология фагов 3:18-6:09 взаимодействие фага с бактериальной клеткой 6:10-8:25 лизогения 8:26-10:21 методы культивирования фагов 10:22-11:56 применение фагов 11:57-16:29

Видеолекция: Бактериофаги и фаговая терапия Лектор: Куликов Евгений Евгеньевич, к.б.н., снс лаборатории вирусов микроорганизмов Института Микробиологии РАН им. С. Н. Виноградского, 2012.

Рисунок: Перенос генетического материала у бактерий с помощью плазмид

conjugation

Рисунок: Конъюгация у бактерий. Источник изображения: https://slipups.ru/2320

Между двумя бактериями устанавливается односторонне направленный контакт — трубочка (pilus), по которой из клетки-донора в клетку-реципиент перемещаются плазмиды, в том числе и те, которые могут нести новые гены для реципиента. Перед переходом каждая плазмида разворачивается из кольца в цепочку и «переползает» в клетку реципиента, где снова собирается в кольцо. Благодаря конъюгации и плазмидам бактерия может передать новый эволюционный признак не только «дочкам», но и «соседям», т.е. не только «по вертикали», но и «по горизонтали».