grad-green grad-gray grad-blue grad-red grad-pink grad-purple grad-yellow
Нести помощь людям

Вход на сайт

Вы здесь

Главная » Физиология » Молекулярная биология » Лекционный курс по Молекулярной биологии

Транскрипция

 

Лекция 6. Транскрипция
 
Определение:
Транскрипция - это синтез всех видов РНК по матрице ДНК, осуществляемый ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой.
У прокариот синтез всех видов РНК осуществляется одним и тем же ферментом.
У эукариот - 3 ядерные РНК-полимеразы, митохондриальные РНК-полимеразы, хлоропластные РНК-полимеразы.
Субстратами для РНК-полимераз служат рибонуклеозид-трифосфаты (активированные нуклеотиды). Весь процесс транскрипции осуществляется за счет энергии макроэргических связей активированных нуклеотидов.
 
 
Принципы транскрипции
1.Комплемептарность.
2.Антипараллельность.
3.Униполярность.
4.Беззатравочностъ.
5.Асимметричность.
РНК синтезируется комплементарно и антипараллельно транскрибируемой цепи ДНК. Рост цепи РНК идет только в направлении 5'→3'. Для начала синтеза РНК фермент не нуждается в поли- или олигонуклеотидной затравке. Первый нуклеотид в РНК всегда пурин в форме трифосфата.
 
Этапы транскрипции
1. Узнавание и прочное связывание
Как только произошло узнавание (позиция 1), РНК-полимераза перемещается в позицию 2. В каталитическом центре инициации транскрипции, находящемся в В-субьединице, оказывается +1-ый нуклеотид оперона. Переход из позиции 1 в позицию 2 возможен, если на операторе нет белка-репрессора.
 
 
Примерно 5% промоторов у прокариот имеют только участок "-10", однако, тем не менее, хорошо узнаются РНК-полимеразой. Такие промоторы представлены палиндромными последовательностями, принимающими форму креста при суперспирализации кольцевых молекул ДНК.
 
Определение
Палиндромы - последовательности, которые читаются одинаково слева направо и справа налево.
 
  Подпись:

Палиндромы первого порядка имеют одну ось симметрии, второго - две, третьего - три.
2. Инициация заключается в образовании первой фосфодиэфирной связи между пурин-трифосфатом (АТФ или ГТФ) и следующим нуклеотидом. После инициации С- фактор покидает фермент.
3. Элонгация - последовательное наращивание цепи РНК (или продолжение транскрипции). Скорость элонгации 40-50 нукл./сек.
Для комплементарного синтеза РНК необходим разрыв водородных связей в ДНК. Core-фермент РНК- полимеразы покрывает примерно 40 пар нуклеотидов (4 витка спирали ДНК). Разрыв водородных связей на 4-х витках спирали - очень энергоемкий процесс. Он не был обнаружен при изучении транскрипции.
Показано, что РНК-полимераза переводит ДНК из В-формы в А-форму. В ней плоскости азотистых оснований не перпендикулярны оси спирали, а наклонены на 20 к перпендикуляру. Это облегчает "выворачивание" двух соседних азотистых оснований в цепи ДНК для того, чтобы напротив них встали комплементарные нуклеотиды РНК. В пользу этого говорит полная идентичность параметров А-формы ДНК и гибрида, состоящего из одной цепи ДНК и одной - РНК. "Мотором" транскрипции является энергия, высвобождающаяся при отщеплении пирофосфата от каждого рибо-НТФ.
Ингибиторы транскрипции прокариот.
Существует множество ингибиторов транскрипции. Они действуют по разныммеханизмам и на разных стадиях. Большинство из них антибиотики.
Рифампицин - ингибитор инициации. Связывается с центром инициации holo-РНК-полимеразы Е. coli.
Стрептолидигин - ингибитор элонгации. Связывается с центром элонгации core-PHK-полимеразы Е. coli.
4. Терминация.
Специфическая терминация бывает р-независимой и р- зависимой.
При р- независимой терминации в терминаторе присутствует палиндром. В синтезируемой РНК формируется шпилька. Шпилька меняет конформацию РНК-полимеразы и фермент теряет сродство к ДНК.
р -зависимая терминация.
р-фактор - это имеющий четвертичную структуру белок? Обладающий АТФ-азной актив-ностью.
Он способен узнавать 5 -конец синтезируемой РНК длиной прибли-зительно 50 нуклеотидов, садиться на него и двигаться по РНК с такой же скоростью, с которой РНК-полимераза движется по ДНК.
В терминаторе много Г — Ц пар (с тремя водородными связями), вследствие чего РНК-полимераза замедляет ход, р-фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента - и синтез РНК прекращается.
 
 
Субъединичный состав РНК-полимеразы E.coli
 
РНК-полимераза E.coli - белок с четвертичной структурой. Одновременно в клетке присутствует около 7000 молекул РНК-полимеразы.
Субъединичный состав фермента: (2α)ββ’σ - holo-фермент (полный фермент). Без σ -фактора это core-фермент (2α)ββ’.
σ(сигма) - фактор - сменный фактор специфичности.
Только holo-фермент обладает высоким сродством к специфической последовательности нуклеотидов - промотору, сродство к остальным случайным последовательностям ДНК у него снижено в 10000 раз. У соге-фермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов.
Сам по себе σ - фактор обладает наименьшим сродством к ДНК по сравнению с другими субьединицами РНК-полимеразы, однако он придает holo-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным сродством к промотору.
Как только произошла инициация транскрипции, σ - фактор отделяется. Элонгация - продолжение синтеза РНК, и терминация - его остановка, осуществляются core-ферментом.
Стадии узнавания и связывания, а также инициации осуществляются holo-ферментом. Элонгация и терминация осуществляются core-ферментом.
Две α субъединицы - каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субъединицы.
β - субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот.
В β - субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой - за элонгацию. Один центр работает в holo-, а другой - в core- ферменте.
 
Понятие об опероне
 
Определение:
Оперон - единица транскрипции у прокариот.
В начале каждого оперона находится промотор. В конце каждого оперона находится терминатор. Перед терминатором располагаются структурные гены, или цистроны. Между промотором и цистронами может находиться оператор. Существуют моно-, олиго- и полицистронные опероны.
 
Определение:
Промотор - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как посадочная площадка и старт синтеза РНК.
Только с промотора может начаться синтез специфической РНК.
 
Определение
Терминатор - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как финиш транскрипции.
Определение: цистрон - последовательность нуклеотидов ДНК, кодирующая один полипептид (в большинстве случаев - белок) или одну tPHK, или одну rРНК.
В большинстве случаев цистроны объединяются в оперон по следующему принципу: закодированные в них белки принимают участие в одной биохимической цепи реакций.
Определение: оператор - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая белком-репрессором.
У оператора диспетчерская функция - он разрешает или запрещает синтез РНК.
 
Асимметричность
 
Транскрибируются обе цепи ДНК, но в каждом отдельном опероне только одна из них. Какая именно, определяется положением промотора и терминатора.
 
Особенности структуры промотора
 
Для изучения структуры промоторов провели следующий эксперимент. При оптимальных условиях связывания получили комплекс РНК-полимеразы с ДНК. Этот комплекс обработали ДНК-азой, и таким образом гидролизовали всю ДНК, незащищенную РНК-полимеразой. После этого отделили РНК-полимеразу от оставшихся фрагментов ДНК. Опять создали оптимальные условия для образования комплекса. Комплекс не образовывался.
Отсюда следует вывод, что узнавание и прочное связывание происходит на разных участках ДНК.
Эти участки отличаются и по первичной, и по вторичной структуре. Путем секвенирования выявили структуру многих промоторов. У большинства из них имеется общее свойство.

РНК-полимераза узнает промотор, покрывая 40-60 пар нуклеотидов. В промоторе узнается взаимное расположение двух расплавленных АТ-богатых участков. В каждом из них расплавлении 4-6 пар. Центры этих участков находятся в положениях "-10" и "-35". Принципиально важным является расстояние между расплавленными участками. Оно колеблется от 16 до 19 п.н. Искусственное увеличение этого расстояния до 20 п.н. или уменьшение его до 15 п.н. приводит к тому, что РНК-полимераза не узнает испорченный промотор.

Источники: Дымшиц Г.М. Молекулярная биология: http://www.medliter.ru/?page=get&id=012131

Поделиться с друзьями:
Ваша оценка: 
3.23077
Средняя: 3.2 (13 проголосовавших)