grad-green grad-gray grad-blue grad-red grad-pink grad-purple grad-yellow
Нести помощь людям

Вход на сайт

Вы здесь

Главная » Физиология » Молекулярная биология » Лекционный курс по Молекулярной биологии

Топология репликации ДНК

Лекция 14. Топология репликации ДНК

Топологические проблемы репликации ДНК
SSB
Белки Альбертса, обнаруженные в 1968 г., снижают температуру плавления ДНК in vitro на 20-40С. Они связываются с ДНК электростатически, хотя имеют отрицательный заряд. Эти белки содержат кластер положительно заряженных аминокислотных остатков, но общий заряд белка отрицателен. У них повышенное сродство к одноцепочечной ДНК. Белок не связывается с двуцепочечной ДНК, не имеющей расплавленных участков.
Но если есть одноцепочечная ДНК, то белки легко садятся на нее, выпрямляют ее, превращая ДНК в "палку".
Белки связываются с двуцепочечной ДНК, если в ней есть нарушения вторичной структуры.
Когда в ДНК образуется расплавленный участок, белок покрывает его за счет электростатических взаимодействий. При этом проявляется сродство белков друг к другу. Они покрывают ДНК сплошным слоем (стехиометрическое количество белка).
Белки, сидящие на комплементарных цепях, не дают цепям схлопнуться, т.к. имеют мощный отрицательный заряд. Называются эти белки SSB (single strand bind).
Они не денатурируют ДНК, а лишь фиксируют одноцепочечное состояние.
Участие SSB в репликации абсолютно необходимо. Они удерживают матричные цепи ДНК в репликативной вилке в одноцепочечном состоянии, а также защищают одноцепочечную ДНК от действия нуклеаз. Они избирательно стимулируют работу ДНК-полимеразы. РНК-полимераза не может использовать одноцепочечную ДНК, покрытую SSB. Избирательность касается и вида. Например, SSB фага Т4 стимулирует ДНК- полимеразу фага Т4, но не ДНК-полимеразы Е. сoli.
SSB не ферменты - они нужны в стехиометрическом количестве.
 
Геликазы
В 1974г найдены геликазы.
Определение: геликазы - ферменты, денатурирующие ДНК.
У E.coli есть четыре геликазы: геликаза I, геликаза II, геликаза III и rep-белок.
Rep-геликаза используется при репликациии II одноцепочечных ДНК-содержащих фагов. Для репликации бактериальной ДНК она не нужна.
Геликазы различаются требованиями к размеру посадочной площадки, на которую они садятся для начала движения.
Площадка - это одноцепочечный участок ДНК, т.е. геликаза не может начать плавление нативной ДНК без дефектов.
Как образуется такая площадка в нативной ДНК? Эта проблема решается с помощью топоизомераз.
 
Топоизомеразы
Определение: топоизомеразы - ферменты, изменяющие топологию ДНК.
Топоизомеразы меняют число зацеплений одной цепи за другую.
Делятся на два класса:
Тип I (релаксазы) - уменьшают число зацеплений.
Тип II (гиразы) - увеличивают число зацеплений.
Гиразы вносят двуцепочечный разрыв ДНК по принципу работы рестриктаз.
Определение: рестриктазы - эндонуклеазы, которые узнают определенные последовательности и делают разрезы в обеих цепях.
После разрыва цепей гираза поворачивает концы ДНК на 360 и проявляет лигазную активность, т.е. сшивает цепи ДНК. В этом процессе используется энергия АТФ. Результат деятельности гираз - супервитки.
Суперспирализованная ДНК напряжена. При высоком напряжении в суперспирали в некоторых местах цепи расходятся, т.к. расплавляются А-Т богатые участки.
Гиразы имеют отношение и к транскрипции, поскольку при напряжении в молекуле ДНК плавятся А-Т богатые районы промоторов, а палиндромы переходят в форму креста.
Все природные кольцевые двуцепочечные ДНК имеют отрицательную суперспирализацию. Один супервиток приходится на каждые 200 пар нуклеотидов.
У релаксаз есть только эндонуклеазная и лигазная активности, но нет АТФ-азной.
Они разрывают только одну цепь. Происходит раскручивание напряженной ДНК, после чего релаксаза сшивает концы. Релаксаза узнает определенную конформацию суперспирализованной молекулы ДНК и режет ее, сбрасывая тем самым лишнме супервитки.
Регуляция транскрипции в бактериальной клетке осуществляется не только на уровне белков репрессоров (активаторов), но и на уровне активности гираз и релаксаз.
 
Современная схема репликации ДНК E. сoli
Белки, участвующие в репликации ДНК E.сoli.
Название
Мол.вес (кДа)
Число субъединиц
Количество молекул на клетку
Функция
Гираза
 
gyrA
 
gyrB
400
 
210
 
190
4
 
2
 
2
25
суперскручивание для плавления ori
эндонуклеазная и лигазная активности
АТФ-азная активность
SSB
76
4
300
Фиксация одноцепочечной ДНК
Геликаза
   I
 II
  III

180
75
56

1
1
1
 
5000
Плавление ori в репликативной вилке
Белки препрайминга 
Препрайминг
priA
82
1
50
3'5' геликаза по запаздывающей цепи, удаляет SSB
dnaT
66
3
50
 
n
14
2
80
 
n'
76
1
70
АТФ-аза
n"
17
1
 
 
dnaC
29
1
100
 
dna B
330
6
20
5'3' геликаза по запаздывающей цепи
Праймаза dnaG
60
1
50
Синтез РНК-затравок (праймеров)
ДНК-полимераза III
Синтез ДНК
holo-фермент
 
800
260
50
20 
142
104
64
160
16
2
2
2
2
2
2
4
20
 
 
 
 
 
 
 
 
полимеразная
5'3' активность
гидролитическая
3' 5' активность
 
 
 
 
 
ДНК-полимераза I
109
1
300
Удаление праймеров и заполнение брешей
Лигаза
74
1
300
Сшивание фрагментов Оказаки
           
У E.coli один origin репликации и две репликативные вилки. Сегодня популярна модель "тромбона", согласно которой ДНК-полимераза III образует асимметричный димер и одновременно ведет непрерывный синтез лидирующей цепи и фрагментов Оказаки запаздывающей цепи.
 
 
Источники: Дымшиц Г.М. Молекулярная биология: http://www.medliter.ru/?page=get&id=012131
Поделиться с друзьями:
Ваша оценка: 
4
Средняя: 4 (2 проголосовавших)