grad-green grad-gray grad-blue grad-red grad-pink grad-purple grad-yellow
Нести помощь людям

Вход на сайт

Схемы репликации ДНК

Лекция 13. Схемы репликации ДНК in vivo
 
Схема непрерывной антипараллельной репликации in vivo по Корнбергу
 
1960 г. Гипотетическая модель.
Суть предположения: неизвестный фактор денатурирует концы линейной молекулы, 3'-ОН-концы загибаются и служат затравками для работы ДНК-полимеразы. Фермент осуществляет денатурацию матричной ДНК по мере продвижения и синтеза дочерних цепей. На выходе - дочерние молекулы, которые короче на загнутый конец, т.к. эндонуклеаза вносит разрыв в материнскую цепь.
 
 
1963 г. Авторадиография
 
 
Бактерии выращивались на среде с радиоактивным H3-тимидином в течение 5-и, 10-и, 15-и мин., после чего проводили авторадиографию.
Ширина полос засветки соответствовала двум меченым нитям ДНК (если помечена одна цепь, то полоса будет получаться уже).
В модели допускалось наличие фермента, способного вести синтез в направлении 3' 5'. Такой фермент не найден и сегодня.
 
Модель неверна, однако, она побудила искать новые ДНК-полимеразы и в Е. coli были найдены еще две: II и III.
 
Сравнительные характеристики ДНК-полимераз E. сoli
Функция
ДНК-полимераза I
ДНК-полимераза II
ДНК-полимераза III
Полимеризация в 5' 3' направлении
+
+
+
Гидролитическая активность 3' 5'
+
+
+
Гидролитическая активность 5' 3'
+
-
-
Потребность в матрице-затравке:
 
Нативная двуцепочечная ДНК
-
-
-
Одноцепочечная ДНК с олигонуклеотидной затравкой
+
-
-
2-х цепочечная ДНК с ником
+
-
-
или с пробелом меньше 100 нуклеотидов
+
+
+
или с пробелом больше 100 нуклеотидов
+
-
-
Оптимальная концентрация KCl
Активность
20мМ
60%
60%
100%
50мМ
80%
100%
50%
100мМ
100%
70%
10%
150мМ
80%
50%
0%
Влияние 10% этанола
40%
45%
200%
Молекулярный вес (кДа)
109
120
субъединич.состав
Число оборотов, принимая за единицу 667 нукл/мин.
1
0.05
15
Число молекул на клетку
250
100
20
К репликации имеют отношение полимеразы I и III.
Причем именно полимераза III является репликазой, т.е. она синтезирует in vivo новые цепи ДНК.
Участие ДНК-полимеразы I необходимо. У нее вспомогательная, репаративная функция.
ДНК-полимераза II имеет отношение лишь к репарации.
 
Схема прерывистой антипараллельной репликации Рейджи Оказаки
1968 г.
Исходные посылки: все данные Корнберга, полученные в ферментативной системе in vitro, и "картинки" Кэрнса верны ( но картинки неправильно интерпретированы).
Оказаки специально разработал два новых метода исследования.
1. Метод импульсного мечения. До Оказаки метку давали в культуральную среду и быстро начинали отмывать клетки, но минимальное время подачи метки было 5 мин. Оказаки через нужный момент времени после добавления меченого тимидина давал 1000-кратный избыток холодного (немеченого) тимидина. Таким образом, метка включается только в течение очень короткого времени.
Оказаки считал, что время Кэрнса (5 мин.) очень велико для получения истинной картины происходящего при репликации.
2. Центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы.
Сахароза разводится на щелочи. В щелочной среде происходит денатурация ДНК. В этом случае короткие фрагменты ДНК, если они есть, отделяются от длинных. После этого их можно выявить при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы, разделяющем молекулы по молекулярному весу.
Оказаки предположил, что синтез ДНК идет короткими фрагментами и что короткие фрагменты должны сшиваться.
Сшиваются они лигазой. ДНК-лигаза была обнаружена как у прокариот, так и у эукариот. У E. сoli были найдены мутанты по лигазе.
Оказаки провел эксперимент на бактериях, зараженных фагом Т4, у которого есть своя термочувствительная лигаза, которая работает при 20С и не работает при 43С. Если в клетку попадает фаговая ДНК, то клетка переключается на репликацию ДНК фага.
Клетки заражали фагом Т4, давали импульсную метку Н3-тимидин и выращивали при двух температурах: 20С и 43С. Потом проводили центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы.
Лигаза E. coli нуждается в коферменте НАД, а лигаза фага - в АТФ. Если E.coli не давать никотиновую кислоту (предшественник НАД), бактериальная ДНК реплицируется, но не сшивается.
Прерывистость репликации показана для всех объектов, кроме фагов, содержащих одноцепочечную ДНК.
У некоторых фагов и вирусов прерывистый синтез идет по обеим цепям. У бактерий и высших организмов одна цепь образуется непрерывно, а другая - прерывисто (лидирующая и запаздывающая цепи).
Размер фрагментов Оказаки видоспецифичен и составляет для фагов 1000-2000 нукл., E. сoli - 1000 нукл., для эукариот - 200-400 нукл.
У фага Т7 обе цепи ДНК тоже реплицируются прерывисто. Они имеют разную плотность (в одной больше пуринов). Цепи были разделены в градиенте плотности CsCl и помещены на две колонки. Была осуществлена ковалентная привязка, поэтому они не могли сойти со смолы. Потом провели репликацию в условиях импульсного мечения. Пропустили все фрагменты через первую колонку. Выход был 50%. Остальные прогнали через вторую колонку. Выхода не было. Таким образом, было показано, что фрагменты комплементарны обеим матричным цепям. Значит, фрагменты образуются по обеим цепям
 
Схема размножения фага М13
1974 г. Оказаки.
 
Рифампицин - ингибитор бактериальной РНК-полимеразы (на стадии инициации).
Хлорамфеникол - ингибитор трансляции на бактериальных рибосомах.
Если одновременно с заражением E. сoli фагом добавить хлорамфеникол, то блокируются трансляция, репликация II и сборка фагов.
Если подействовать рифампицином, то блокируется не только транскрипция и все следующие процессы, но и репликация I.
Вывод: бактериальная РНК-полимераза участвует в репликации ДНК фага.
Вся фаговая ДНК составляет ~6000 нукл.
Определение: origin (ori) - район начала репликации.
 В районе ori (начало репликации) имеется 4 шпильки. Эти шпильки опознаются РНК-полимеразой, и вторая шпилька используется в качестве матрицы. По мере образования РНК шпилька плавится. Образуется РНК-затравка длиной 24 нукл., 3'-конец которой используется ДНК полимеразой III.
Когда 3'-конец синтезируемой цепи ДНК "утыкается" в 5'-конец РНК-затравки, ДНК-полимераза III вытесняется ДНК-полимеразой I, которая, обладая 5'→3' гидролитической активностью, "съедает" РНК-затравку, одновременно продолжая синтез ДНК. Когда затравка (РНК) съедена, ДНК-полимераза I вытесняется лигазой, которая сшивает концы ДНК.
Все эти ферменты (ДНК-полимераза III, ДНК-полимераза I, лигаза) входят в состав реплисомы. Они представляют единый белковый комплекс, который реагирует изменением конформации на выполнение очередной функции.
Протяженная (более 100 нукл.) одноцепочечная ДНК-матрица может быть использована ДНК полимеразой III, когда полимераза III представлена в форме holo-фермента. Помимо субъединицы , обладающей полимеразной активностью, в holo-фермент входит еще несколько субъединиц, обеспечивающих высокую процессивность синтеза ДНК.
Фаг X174
Репликация ДНК этого фага не зависит от рифампицина.
Здесь работает не обычная РНК-полимераза, а особый фермент - праймаза. Он умеет делать только РНК-затравку.
Праймаза нуждается в дополнительных факторах - белках препрайминга. Точно так же (с помощью праймазы и белков препрайминга) образуются РНК-затравки при репликации ДНК E. сoli.
Праймосома - это белки препрайминга и праймаза.
Белки движутся по матричной цепи ДНК в 5' 3' направлении, праймаза - в противоположном, синтезируя РНК-затравки в организованных с помощью белков препрайминга участках ДНК на расстоянии ~1000 нукл. друг от друга.
Источники: Дымшиц Г.М. Молекулярная биология: http://www.medliter.ru/?page=get&id=012131
 
Ваша оценка: 
4.333335
Средняя: 4.3 (3 проголосовавших)