Схемы репликации ДНКЛекция 13. Схемы репликации ДНК in vivo Схема непрерывной антипараллельной репликации in vivo по Корнбергу 1960 г. Гипотетическая модель. ![]() ![]() 1963 г. Авторадиография ![]() Бактерии выращивались на среде с радиоактивным H3-тимидином в течение 5-и, 10-и, 15-и мин., после чего проводили авторадиографию. ![]() В модели допускалось наличие фермента, способного вести синтез в направлении 3' ![]() Модель неверна, однако, она побудила искать новые ДНК-полимеразы и в Е. coli были найдены еще две: II и III. Сравнительные характеристики ДНК-полимераз E. сoli
К репликации имеют отношение полимеразы I и III. Причем именно полимераза III является репликазой, т.е. она синтезирует in vivo новые цепи ДНК. Участие ДНК-полимеразы I необходимо. У нее вспомогательная, репаративная функция. ДНК-полимераза II имеет отношение лишь к репарации. Схема прерывистой антипараллельной репликации Рейджи Оказаки 1968 г. Исходные посылки: все данные Корнберга, полученные в ферментативной системе in vitro, и "картинки" Кэрнса верны ( но картинки неправильно интерпретированы). Оказаки специально разработал два новых метода исследования. 1. Метод импульсного мечения. До Оказаки метку давали в культуральную среду и быстро начинали отмывать клетки, но минимальное время подачи метки было 5 мин. Оказаки через нужный момент времени после добавления меченого тимидина давал 1000-кратный избыток холодного (немеченого) тимидина. Таким образом, метка включается только в течение очень короткого времени. Оказаки считал, что время Кэрнса (5 мин.) очень велико для получения истинной картины происходящего при репликации. 2. Центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы. Сахароза разводится на щелочи. В щелочной среде происходит денатурация ДНК. В этом случае короткие фрагменты ДНК, если они есть, отделяются от длинных. После этого их можно выявить при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы, разделяющем молекулы по молекулярному весу. Оказаки предположил, что синтез ДНК идет короткими фрагментами и что короткие фрагменты должны сшиваться. Сшиваются они лигазой. ДНК-лигаза была обнаружена как у прокариот, так и у эукариот. У E. сoli были найдены мутанты по лигазе. Оказаки провел эксперимент на бактериях, зараженных фагом Т4, у которого есть своя термочувствительная лигаза, которая работает при 20 ![]() ![]() Клетки заражали фагом Т4, давали импульсную метку Н3-тимидин и выращивали при двух температурах: 20 ![]() ![]() ![]() Лигаза E. coli нуждается в коферменте НАД, а лигаза фага - в АТФ. Если E.coli не давать никотиновую кислоту (предшественник НАД), бактериальная ДНК реплицируется, но не сшивается. Прерывистость репликации показана для всех объектов, кроме фагов, содержащих одноцепочечную ДНК. У некоторых фагов и вирусов прерывистый синтез идет по обеим цепям. У бактерий и высших организмов одна цепь образуется непрерывно, а другая - прерывисто (лидирующая и запаздывающая цепи). ![]() Размер фрагментов Оказаки видоспецифичен и составляет для фагов 1000-2000 нукл., E. сoli - 1000 нукл., для эукариот - 200-400 нукл. У фага Т7 обе цепи ДНК тоже реплицируются прерывисто. Они имеют разную плотность (в одной больше пуринов). Цепи были разделены в градиенте плотности CsCl и помещены на две колонки. Была осуществлена ковалентная привязка, поэтому они не могли сойти со смолы. Потом провели репликацию в условиях импульсного мечения. Пропустили все фрагменты через первую колонку. Выход был 50%. Остальные прогнали через вторую колонку. Выхода не было. Таким образом, было показано, что фрагменты комплементарны обеим матричным цепям. Значит, фрагменты образуются по обеим цепям ![]() Схема размножения фага М13 ![]() Рифампицин - ингибитор бактериальной РНК-полимеразы (на стадии инициации). Хлорамфеникол - ингибитор трансляции на бактериальных рибосомах. Если одновременно с заражением E. сoli фагом добавить хлорамфеникол, то блокируются трансляция, репликация II и сборка фагов. Если подействовать рифампицином, то блокируется не только транскрипция и все следующие процессы, но и репликация I. Вывод: бактериальная РНК-полимераза участвует в репликации ДНК фага. Вся фаговая ДНК составляет ~6000 нукл. Определение: origin (ori) - район начала репликации. ![]() ![]() Когда 3'-конец синтезируемой цепи ДНК "утыкается" в 5'-конец РНК-затравки, ДНК-полимераза III вытесняется ДНК-полимеразой I, которая, обладая 5'→3' гидролитической активностью, "съедает" РНК-затравку, одновременно продолжая синтез ДНК. Когда затравка (РНК) съедена, ДНК-полимераза I вытесняется лигазой, которая сшивает концы ДНК. Все эти ферменты (ДНК-полимераза III, ДНК-полимераза I, лигаза) входят в состав реплисомы. Они представляют единый белковый комплекс, который реагирует изменением конформации на выполнение очередной функции. Протяженная (более 100 нукл.) одноцепочечная ДНК-матрица может быть использована ДНК полимеразой III, когда полимераза III представлена в форме holo-фермента. Помимо субъединицы ![]() Фаг ![]() Репликация ДНК этого фага не зависит от рифампицина. Здесь работает не обычная РНК-полимераза, а особый фермент - праймаза. Он умеет делать только РНК-затравку. Праймаза нуждается в дополнительных факторах - белках препрайминга. Точно так же (с помощью праймазы и белков препрайминга) образуются РНК-затравки при репликации ДНК E. сoli. Праймосома - это белки препрайминга и праймаза. ![]() ![]() Источники: Дымшиц Г.М. Молекулярная биология: http://www.medliter.ru/?page=get&id=012131 Ваша оценка:
|