Рестриктазы

Краткое описание:

Библиографическая ссылка для цитирования: Сазонов В.Ф. Рестриктазы [Электронный ресурс] // Кинезиолог, 2009-2022: [сайт]. Дата обновления: 30.12.2022. URL: https://kineziolog.su/content/restriktazy (дата обращения: __.__.20__). _______________________________

Рестриктазы - молекулярные ножницы биотехнологов и генных инженеров

Рестриктазы или рестриктирующие эндонуклеазы - это ферменты, узнающие определенные последовательности (сайты рестрикции) в двухцепочечной ДНК и расщепляющие данную молекулу именно в этих сайтах. Их выделяют преимущественно из прокариотических клеток.

Рестриктазы относятся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот. Они также являются эндонуклеазами, потому что расщепляют нуклеиновые кислоты не с краёв, а из центра молекул.

Рестриктазы бактерий – это их орудие защиты от чужеродных нуклеиновых кислот. Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина (маскированием). Системы рестрикции и модификации широко распространены у бактерий.
Названия рестриктазам часто даются по первым буквам микроорганизмов, из которых они были выделены, например:
EcoRI – рестриктаза, выделенная из E.coli (кишечной палочки).

Итак, сайт рестрикции (restriction site) (англ. site участок, местоположение; лат. restrictio ограничение) - это короткая нуклеотидная последовательность в молекуле ДНК (обычно 4-8 п.н.), узнаваемая рестриктазой, которая определяет место расщепления данным ферментом данной молекулы ДНК.

По механизму действия и молекулярной структуре различают три типа рестриктаз. Но рестриктазы 2-го типа - самые значимые из них.
Рестриктазы типа II - основной инструмент генной инженерии. Большинство рестриктаз типа II специфически узнают на ДНК тетра- и гексануклеотидные последовательности, а по крайней мере три из них - октануклеотидные. Чем короче олигонуклеотидная последовательность сайта рестрикции, узнаваемого рестриктазой, тем чаще он встречается в случайной последовательности нуклеотидов в составе ДНК, в которой каждый из четырех нуклеотидов представлен с одинаковой частотой.

Как работают рестриктазы

Рестриктазы разрезают ДНК либо внутри, либо около своих сайтов узнавания, которые обычно представляют собой последовательность двухцепочечной ДНК длиной всего 4-6 нуклеотидов, обладающую осью симметрии второго порядка.
В результате разрыва образуются фрагменты с выступающими липкими 5’-концами. Каждый такой конец может взаимодействовать с любым другим липким концом, комплементарным ему. Таким образом, любые молекулы ДНК, содержащие одинаковые сайты рестрикции можно соединять друг с другом и в результате получать рекомбинантные молекулы ДНК.

Одна единица активности (е.а.) рестриктазы - это количество фермента, необходимое для расщепления 1 мкг ДНК бактериофага лямбда за 1 час при температуре 37°С в реакционной смеси объёмом 50 мкл. Условия реакции: 1Х NEB-буфер 3.1, инкубировать при 37°С.

Инактивация: 80°С в течение 20 мин.
Температура хранения: -20°С.

Правила работы с рестриктазами

Прежде, чем начать работать с рестриктазами, следует запомнить следующие правила:
1. Рестриктазы никогда не вынимаются из ледяной бани или холодного штатива.
2. Рестриктазы отбирают только новыми наконечниками.
3. Для рестрикции надо использовать только тридистиллированную воду и использовать только новые наконечники, т.к. на вымытых наконечниках могут оставаться фрагменты неизвестных вам нуклеиновых кислот, и вы рискуете заклонировать именно их, а не нужный вам фрагмент.

Ферменты рестрикции высокой точности (HF) обладают 100%-ной активностью в буфере rCutSmart; а использование одного буфера означает более простую и оптимизированную обработку образцов. Все ферменты HF имеют качество, позволяющее экономить время, и могут разрезать ДНК субстрата за 5-15 минут.

Примеры рестриктаз

Типичная рестриктаза EcoRI – это димер (2х31тыс.). Она режет по очереди сначала одну цепь ДНК, а потом другую. Последовательности, фланкирующие сайт узнавания, определяют выбор цепи, которая будет разрезана, и таким образом влияют на эффективность разрезания.

Эндонуклеаза рестрикции EcoRV – фермент, катализирующий гидролиз двухцепочечной ДНК внутри специфического сайта рестрикции.

Сайт рестрикции EcoRV:

saytrestrikcii1.gif

EcoRV имеет версию EcoRV-HF^® с высоким качеством воспроизведения.

XbaI - рестриктаза, выделена из бактерии Xanthomonas badrii.

XbaI относится к эндонуклеазам рестрикции (Тип II, подтип P). То есть XbaI распознает палиндромную последовательность ДНК и осуществляет рестрикцию внутри палиндрома в фиксированной точке. В присутствии диметилсульфоксида (ДМСО) и при высоких концентрациях глицерина в среде XbaI теряет способность распознавать палиндром и осуществляет неспецифическую рестрикцию (звёздная активность) После рестрикции образуются липкие концы с выступами из четырёх оснований.

Пример палиндромной последовательности, распознаваемой XbaI и образующиеся после рестрикции продукты

Палиндромный участок: 5'-TCTAGA-3' 3'-AGATCT-5'

Продукты рестрикции: 5'-T // CTAGA-3' 3'-AGATC // T-5'

XbaI рестриктазная активность ингибируется при метилировании аденина (DAM метилаза). Однако, рестриктазная активность сохраняется при метилировании цитозина (DCM- или CpG-метилазы).

После завершения рестрикции ДНК, XbaI может быть инактивирована денатурацией нагреванием до 65°C в течение 20 минут. Температура хранения: -20°С.

XbaI широко используется в молекулярно-биологических исследованиях. В частности, она применяется при клонировании специфических нуклеотидных последовательностей, при рестрикционном анализе. Так например, XbaI использовалась при анализе полиморфизма рецептора эстрогена α и липопротеина а (ApoB).

Pst I - эндонуклеаза рестрикции II типа, выделенная из грамотрицательного вида Providencia stuartii.

Pst I расщепляет ДНК в последовательности распознавания 5'-CTGCA/G-3', образуя фрагменты с 3'- липкими концами. Это расщепление дает липкие концы длиной в 4 пары оснований. PstI каталитически активен в виде димера. Две субъединицы связаны 2-кратной осью симметрии, которая в комплексе с субстратом совпадает с осью диады последовательности распознавания. Он имеет молекулярную массу 69 500 и содержит 54 положительно и 41 отрицательно заряженных остатка.

Hae III - один из многих ферментов рестрикции (эндонуклеаз) для прокариотической ДНК, который защищает организмы прокариот от неизвестной чужеродной ДНК. Это фермент рестрикции, используемый в лабораториях молекулярной биологии. Это третья эндонуклеаза, выделенная из бактерий Haemophilus aegyptius . Сайт распознавания фермента — место, где он разрезает молекулы ДНК, — это нуклеотидная последовательность GGCC, что означает, что он расщепляет ДНК на сайте 5'-GG / CC-3. Скорость распознавания обычно составляет около 4-8 бит/с. Ген этого фермента был секвенирован и клонирован. Это делается для образования фрагментов ДНК с тупыми концами. HaeIII не эффективен для расщепления одноцепочечной ДНК.

Итак, HaeIII расщепляет ДНК в положениях, где обнаружена последовательность GGCC. Расщепление происходит между вторым и третьим нуклеотидами (G и C). Полученные фрагменты ДНК известны как фрагменты рестрикции. HaeIII разрезает обе нити ДНК в одном и том же месте, получая фрагменты рестрикции с тупыми концами. Денатурация при нагревании происходит при 80°C через 20 минут.

Рестриктаза HpaI – фермент, катализирующий гидролиз двухцепочечной ДНК внутри специфического сайта рестрикции:

saytrestrikcii2.gif

Происхождение рестриктазы: штамм E.coli, несущий ген HpaI Haemophilus parainfluenzae (ATCC 49669).
Фермент рестрикции распознает сайт GTT^AAC и лучше всего режет его при 37 °C в течение 5–15 минут с использованием универсального буфера FastDigest.
Изошизомеры: HpaI, BsaKI, BseII, BstEZ359I, BstHPI, MwhI, SsrI, Uba1408II.

Применение: молекулярное клонирование, отображение сайта рестрикции, генотипирование и др.

Источники:

https://studfile.net/preview/4597149/
https://e.vyatsu.ru/mod/page/view.php?id=39323
https://ru.wikipedia.org/wiki/XbaI
https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D0%BD%D0%B4%D0%BE%D0%BD%D1%83%D0%BA...

Поделиться с друзьями:

Ваша оценка:

Войдите или зарегистрируйтесь, чтобы отправлять комментарии